[發明專利]一種胞內勞森菌分離方法

有效

• 申請號: 201710772671.3
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107653201B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 沈建軍;張秀文;李陽
• 申請（專利權）人: 浙江美保龍生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/01
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

一種豬胞內勞森菌的分離培養方法，屬于獸用生物制品技術領域。其包括以下步驟：病料的采集與處理；小鼠的腸上皮原代細胞進行貼壁培養；分離細菌培養。本發明具有以下有益效果：本發明所改變了傳統的病料處理方法，省去了以往繁瑣的操作步驟，提出了一種新的細菌分離液，大大縮短了細菌的分離時間；提出了應用胎鼠的腸上皮原代細胞用來培養細菌，為胞內勞森菌提供了一個模擬體內的體外培養環境，增加了分離細菌的成功率；應用微需氧產氣袋進行培養，解決了價格昂貴的智能多氣培養箱的問題，大大降低了細菌分離成本。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種胞內勞森菌的分離方法。

背景技術

胞內勞森菌(LI)是豬增生性腸炎（PPE）的主要病原，LI宿主多而廣，能夠感染豬、兔、馬、倉鼠、大鼠、豚鼠、猴、小鼠等動物，主要寄生在動物的回腸、結腸、盲腸等部位可引起高度增生。目前，PPE呈世界規模流行，感染率高，在國內呈現逐年增加趨勢，豬死亡率雖然不高，但嚴重降低豬對飼料的利用率而提高生產成本，部分感染病豬并不表現出明顯的臨床癥狀，呈現隱性感染，生產上容易被忽視，同時該病具有流行性廣和危害性大等特點，為了更好的預防和控制PPE，研究LI的分離鑒定就顯的非常重要。

LI是一種嚴格的胞內寄生細菌，而且生存條件要求苛刻，對于LI的分離培養也是一個世界性的難題，常規的培養基難以滿足，只能用細胞來分離培養，目前成功分離到的胞內勞森菌不足20株。傳統的LI分離方法，步驟多，操作麻煩，分離成功率較低，周期一般較長，鑒于此，我們提出了一種高效、方便、快捷分離LI的方法，對于預防和控制PPE具有重要意義。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明目的在于設計提供一種胞內勞森菌分離方法的技術方案，為胞內勞森菌的診斷及研究提供依據。

所述的一種胞內勞森菌分離方法，其特征在于包括以下步驟：

1）取患有增生性腸炎典型癥狀的疑似病豬的回腸，用pH為3.0-5.0的PBS溶液進行洗1-3次，刮取回腸黏膜1-10g，置于勻漿器內進行勻漿，再加入2-10 ml細菌分離液中，充分混勻，置于室溫環境下5-20min，然后按100-500g離心5-10min，取上清，依次通過5.0、1.2、0.45um濾器進行過濾，濾液置于-20℃保存；

2）取小鼠的腸上皮原代細胞進行貼壁培養；

3）將步驟1）得到的胞內勞森菌分離物用10%FBS的HDMEM細胞培養液按1:5-1:10稀釋，加入到匯合度為30%-50%小鼠的腸上皮原代細胞中，之后將細胞瓶置于微需氧產氣袋中培養，氣體有效濃度為8%-15% O₂、5%-10%CO₂，培養3-5d，每天更換一次新的培養液。

所述的一種胞內勞森菌分離方法，其特征在于所述的步驟1）中細菌分離液通過以下步驟得到：

取海藻糖1-10 g、磷酸二氫鉀0.1-0.5 g、氯化鉀0.5-3 g、氯化鈉1-8 g、谷胱甘肽5-20 mg、亞硒酸鈉40-50 umol 、萬古霉素50-100 mg、新霉素10-50 ug、兩性霉素B 0.5-2mg；

將以上各成分混合后，溶于1000 ml雙蒸水中，并且用0.1M的HCL溶液調pH至3.0-5.0，經0.22 um濾膜進行過濾即得，置于4℃保存備用。

所述的一種胞內勞森菌分離方法，其特征在于所述的步驟2）中小鼠的腸上皮原代細胞進行貼壁培養具體為：