[發(fā)明專利]一種用于塞內(nèi)卡病毒抗原檢測(cè)的雙抗夾心ELISA試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710771922.6
• 申請(qǐng)日: 2017-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107741495A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭海學(xué);田宏;楊帆;石正旺;劉華南;張克山;朱紫祥;李丹;劉永杰;何繼軍;郭建宏;蔣韜;劉湘濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，特別涉及基于塞內(nèi)卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)特異性酶標(biāo)抗體技術(shù)建立的用于塞內(nèi)卡病毒抗原檢測(cè)的雙抗夾心ELISA試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

SVV也被稱為塞內(nèi)卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)，其對(duì)美國(guó)豬群來(lái)說(shuō)并不陌生。在過(guò)去30年中，共有近20例SVV感染被確認(rèn)。在美國(guó)，SVV通常與特發(fā)性豬水皰病有關(guān)。在全球范圍內(nèi)都有SVA的報(bào)道，包括加拿大、澳大利亞、意大利、新西蘭和巴西。SVV是一種無(wú)囊膜、單鏈RNA病毒，與豬口蹄疫(FMD)和豬水皰病毒一樣，屬小RNA病毒科。它可能是豬特發(fā)性水皰病的病原體，但是這種觀點(diǎn)尚未得到證實(shí)。

2015年9月，美國(guó)某種豬場(chǎng)豬群出現(xiàn)跛足、水泡且伴隨初生仔豬死亡，PCR檢測(cè)排除FMDV、PDCoV、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、A/B/C型豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬呼吸與繁殖綜合癥病毒(PRRSV)的感染，發(fā)病豬的血清、皮膚、糞便、蹄部冠狀帶的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示為SVV陽(yáng)性，并通過(guò)豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)分離得到SVV。

2015年3月，我國(guó)廣東某豬場(chǎng)超期斷奶豬被發(fā)現(xiàn)跛行，將發(fā)情母豬趕去配種舍定位欄沖洗干凈后，發(fā)現(xiàn)一頭豬出現(xiàn)鼻鏡水泡，送檢水泡液、水泡皮、腳皮樣品，檢測(cè)結(jié)果顯示口蹄疫、豬水皰病病原檢測(cè)均陰性而豬場(chǎng)的發(fā)病仍在擴(kuò)大，最終通過(guò)對(duì)病料進(jìn)行多種病原的檢測(cè)送測(cè)序后獲得一段序列，經(jīng)與基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與SVV序列的相似性最高，繼而查找資料，確定發(fā)病豬群感染SVV，并分離到SVV細(xì)胞株。隨后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陸續(xù)在其他豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)豬群感染SVV病例，而且一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

由于SVV感染動(dòng)物所引起的癥狀與其他病毒性疾病如口蹄疫、水泡性口炎病、豬水皰病臨床表現(xiàn)十分相似，給臨床確診帶來(lái)了難度。因此，需要實(shí)驗(yàn)室技術(shù)加以確定。目前主要包括病毒分離、抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)等?？贵w檢測(cè)方法主要包括血清中和試驗(yàn)(特異性高，廣泛應(yīng)用于血清學(xué)調(diào)查)和ELISA法(適用于豬血清大規(guī)模普查)。病原學(xué)檢測(cè)方法主要是免疫組化試驗(yàn)，該方法是抗原檢測(cè)敏感且特異的方法，主要體現(xiàn)在能定位病原在組織細(xì)胞中的分布。RT-PCR技術(shù)通常具有特異性高、可靠、快速，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè)。目前應(yīng)用于SVV診斷的檢測(cè)方法程序繁多、操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)至少需要一天的時(shí)間才能獲得結(jié)果，因此在疫情突發(fā)時(shí)無(wú)法實(shí)現(xiàn)大量的樣品的即時(shí)檢測(cè)。要克服現(xiàn)狀就必須研制新型ELISA診斷技術(shù)，本發(fā)明所涉及的檢測(cè)方法是以輕簡(jiǎn)化或精準(zhǔn)為目標(biāo)的新型定性定量技術(shù)。

另外，鑒于目前國(guó)內(nèi)外尚未有血清學(xué)診斷方法的報(bào)道，唯一能檢測(cè)抗原的方法為病毒分離，本方法屬于首創(chuàng)SVV抗原檢測(cè)的ELISA試劑盒，相對(duì)于病毒分離而言，本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、敏感、穩(wěn)定及省時(shí)等特點(diǎn)，為SVV抗原檢測(cè)提供了一種有效的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于塞內(nèi)卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗原檢測(cè)的雙抗夾心ELISA試劑盒及其應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種用于塞內(nèi)卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗原檢測(cè)的雙抗夾心ELISA試劑盒，其中包括塞內(nèi)卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶標(biāo)板以及HRP標(biāo)記的塞內(nèi)卡病毒兔抗IgG。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，所述的酶標(biāo)板按照以下方法制備得到：

(1)獲得SVV豚鼠高免血清；

(2)離心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl₂溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室溫?cái)嚢?5分鐘，12000r/min，4℃離心20分鐘，收集上清液；

(3)向步驟(2)得到的上清液中加入等體積飽和硫酸銨溶液，混勻后于4℃靜置4～6小時(shí)，離心棄上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸銨；

(4)先用10倍柱體積的0.02mol/L，pH7.0的Na₃PO₃緩沖液洗親和層析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步驟(3)透析后的樣品，再以5～10倍柱體積的Na₃PO₃緩沖液洗滌，最后用2～5倍柱體積的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脫，收集洗脫液，4℃透析濃縮，得到高純度SVV豚鼠抗IgG；