[發明專利]特異識別赭曲霉毒素A的核酸適配體及其制備方法

有效

• 申請號: 201710771917.5
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107446929B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 張健;李敏;張穎
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;C40B50/06
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明涉及一種特異識別赭曲霉毒素A的核酸適配體及其制備方法，該單鏈DNA適配體的序列為序列1，本發明所述赭曲霉毒素A核酸適配體是通過基于氧化石墨烯分離的指數富集配體系統進化技術，體外篩選獲得了高親和力且特異識別OTA毒素的單鏈寡核苷酸適配體，具有特異性好，穩定性高，成本低廉，易于合成與修飾，使用方便，無毒等特點，可以研制出基于核酸適配體的生物傳感器、固相親和凈化柱以及農產品中快速檢測的分析方法等。

技術領域

本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種赭曲霉毒素A核酸適配體及其制備方法。

背景技術

赭曲霉毒素A(OTA)是曲霉屬和青霉屬等通過正常的生物代謝而產生的次生代謝產物，在谷物、小麥、大麥等糧食中廣泛存在，研究表明，OTA的毒性不單單表現為胚胎毒性、肝臟毒性和腎臟毒性，而且還具有致畸、致癌、致突變和免疫抑制作用。由于OTA具有的強致癌和致病性，國際機構和世界各國對赭曲霉毒素在食品中的限量做了非常嚴格的規定，歐盟(EC)對谷物和谷物制品中OTA的最大殘留量分別是5和3μg/Kg，對酒和葡萄汁中OTA的最大殘留限量是2μg/Kg；在國家標準GB 2761-2011中對谷物和豆類及其制品中OTA的限量為5μg/Kg。因此,研究建立靈敏、準確可靠的赭曲霉毒素A檢測技術,是控制我國農產品污染、保障農產品安全消費和人民身體健康的迫切需求。

目前，OTA毒素的測定方法主要有兩大類：化學分析法和免疫分析法。薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、液相色譜質譜聯用法(LC-MS)等這些化學分析方法準確、靈敏，但是樣品通常需要復雜的前處理，費時費力；所用檢測設備昂貴，且需要專業的操作人員。酶聯免疫法(ELISA)是目前常見的真菌毒素的免疫檢測方法，該方法的特點是快速、成本較低、操作簡單，但是ELISA屬于非均相方法，需要多次反復洗滌步驟，除此之外，抗體的制備周期長而且成本昂貴,且制得的抗體批次間差異大，受環境條件如溫度、pH值影響很大，因此在儲存和使用條件上，抗體的穩定性易受影響。

核苷酸適配體是通過SELEX(Systematic Evolution ofLigands by ExponentialEnrichment)，指數富集的配體系統進化)技術篩選的與靶物質特異性結合的一類單鏈DNA或RNA片段。與抗體相比具有可體外篩選獲得、生產周期短、熱穩定性好、易于化學合成和修飾等優點。

基于是否固定文庫或靶標，可將篩選方法分成以下三大類:(Ⅰ)固定靶標的核酸適配體篩選方法；(Ⅱ)固定文庫的核酸適配體篩選方法；(Ⅲ)免固定的核酸適配體篩選方法。近幾年OTA適配體的篩選方法有：固定靶標的親和層析柱法，固定文庫的磁珠法。這兩種方法往往需要固定文庫或靶標，但經固定的文庫或靶標的天然構象在一定程度上可能會受到影響。此外，用于固定的載體還會對文庫與靶標的結合產生空間位阻，這些都不利于篩選得到游離態下結合能力強的序列，因此發展非固定的的核酸適配體篩選方法顯得尤為重要。本文采用免固定的核酸適配體篩選方法，利用氧化石墨烯能夠很好的吸附單鏈DNA并可經離心去除的特點，將氧化石墨烯引入到篩選的過程中，降低非特異性吸附，有效地去除未結合的單鏈DNA，并且不影響適配體與靶標的結合。該方法大大地提高了篩選的效率，節約了勞動力和降低了成本。

該寡核苷酸適配體可用于分析檢測OTA毒素以豐富實驗室檢測手段,并可用于開發適配體傳感器以實現快速檢測,因此該發明可以在OTA毒素檢測領域得到廣泛應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能與OTA毒素特異性結合的寡核苷酸適配體，為開發OTA毒素的分析檢測工具奠定良好基礎。

本發明的另一目的是提供一種制備OTA毒素寡核苷酸適配體的方法，它可以方便、準確地獲取OTA毒素的高親和力單鏈DNA適配體，效果顯著。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種特異識別赭曲霉毒素A的核酸適配體，所述核酸適配體為單鏈DNA寡核苷酸適配子，序列為序列1。