[發(fā)明專(zhuān)利]豬CD4基因功能突變位點(diǎn)分子育種標(biāo)記的鑒定及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710771839.9
• 申請(qǐng)日: 2017-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109423522B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙書(shū)紅;李新云;倪娟;張杰;劉華珍;朱猛進(jìn);劉小磊;馬云龍;余梅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C07K14/73;C12N15/12
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 肖艷;劉真真

本發(fā)明提供了豬CD4基因功能突變位點(diǎn)分子育種標(biāo)記的鑒定及應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了CD4基因的4個(gè)功能突變位點(diǎn)，所述的4個(gè)突變位點(diǎn)影響CD4基因的表達(dá)水平、膜定位以及免疫水平。該分子標(biāo)記的4個(gè)關(guān)鍵突變位點(diǎn)特征為在CDS區(qū)域第193(A/G)、195(G/C)、196(A/G)、202(C/G)位堿基處存在突變。本發(fā)明為豬免疫性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及豬CD4基因功能突變位點(diǎn)分子育種標(biāo)記的鑒定及應(yīng)用。

背景技術(shù)

規(guī)模化養(yǎng)殖的優(yōu)勢(shì)在于可以降低養(yǎng)殖成本，使養(yǎng)殖走向標(biāo)準(zhǔn)化，食品安全更有保障。面對(duì)疫病挑戰(zhàn)，養(yǎng)豬人往往會(huì)做出兩種選擇：大劑量使用抗生素和頻繁接種各種疫苗。雖然抗生素能夠殺死大部分有害菌，但是耐藥性、藥物殘留等問(wèn)題不容忽視。頻繁接種疫苗不但增加養(yǎng)殖成本，而且容易對(duì)豬造成應(yīng)激。因此，在飼養(yǎng)環(huán)節(jié)做好飼料質(zhì)量把控、豬場(chǎng)及飼養(yǎng)人員消毒管理、疾病防疫等工作尤為重要。此外，還可以從根源上尋找途徑，培育抗病新品系，減少疾病發(fā)生的機(jī)會(huì)，這從長(zhǎng)遠(yuǎn)看不僅降低養(yǎng)殖成本，還可以改善豬肉食品環(huán)境。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠抵抗細(xì)菌、病毒等抗原而使機(jī)體免于疾病傷害，免疫系統(tǒng)分為固有免疫(非特異性免疫)和適應(yīng)性免疫(特異性免疫)，適應(yīng)性免疫又分為體液免疫和細(xì)胞免疫。CD₄⁺T細(xì)胞作為一類(lèi)重要的免疫細(xì)胞，其在體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。

CD(Cluster of Differentiation)是位于淋巴細(xì)胞表面一類(lèi)分化抗原的總稱(chēng)。CD4為表達(dá)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的單鏈糖蛋白。CD4胞外區(qū)通過(guò)與MHCII類(lèi)分子的結(jié)合來(lái)穩(wěn)定TCR與抗原肽-MHCII類(lèi)分子復(fù)合物；CD4的胞內(nèi)區(qū)通過(guò)半胱氨酸基序招募Lck聚集于TCR中間形成大分子簇，使得TCR-CD3上的ITAM(ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif)得以被Lck磷酸化從而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。

已有研究報(bào)道CD4基因的突變和免疫疾病、病毒感染相關(guān)。人CD4基因啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)堿基的突變和I型糖尿病的發(fā)生有關(guān)；CD4基因增強(qiáng)子區(qū)域的2個(gè)堿基突變與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)；CD4分子作為HIV-I的主要受體，研究發(fā)現(xiàn)CD4D1區(qū)的突變可以改變其與HIV-I的親和力；獼猴CD4基因上第39位的氨基酸突變可能與其對(duì)HIV病毒具有抵抗力有密切關(guān)系。

基于CD4基因在免疫調(diào)節(jié)中的重要性，其可以作為豬抗病育種的候選基因，但是目前對(duì)于豬CD4基因的功能突變研究仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本領(lǐng)域迫切需要對(duì)豬CD4基因的功能突變研究

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供豬CD4基因4個(gè)功能突變位點(diǎn)的鑒定及應(yīng)用。

具體地，申請(qǐng)人通過(guò)GWAS(Genome Wide Association Study)的方法，對(duì)杜洛克×二花臉F2群體的T細(xì)胞亞群(CD₄⁺T％)和60K基因芯片(Illumina,USA)進(jìn)行了分析，分析發(fā)現(xiàn)CD4基因位于該性狀的候選區(qū)域內(nèi)，具體結(jié)果見(jiàn)附圖2。

申請(qǐng)人通過(guò)基因克隆的方法，利用如下引物對(duì)：

正向引物：CTCGGCAAAACCACAATG(見(jiàn)序列表SEQ ID NO:3)

反向引物：GGAAAAGGGAAAGAGGAAGAAAG(見(jiàn)序列表SEQ ID NO:4)；

對(duì)杜洛克×二花臉F2群體的cDNA進(jìn)行CD4基因的PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析得到兩種單倍型，單倍型的序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO:1(單倍型A)和SEQ ID NO:11(單倍型B)。申請(qǐng)人再在得到的兩種單倍型序列基礎(chǔ)上，利用突變引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到D1區(qū)部分位點(diǎn)突變的序列，將擴(kuò)增得到的片段連接重組后插入超表達(dá)載體pEGFP-n1中。