[發明專利]一種Mdr1a/1b雙基因敲除的方法及應用

有效

• 申請號: 201710771262.1
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN109423500B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 王昕;趙軍芳;魯健;劉明耀
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027;C12N15/113;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 夏思秋

1.一種Mdr1a/1b雙基因敲除的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)Mdr1a與Mdr1b靶點的選擇；

利用在線靶點預測網站選擇Mdr1a與Mdr1b敲除靶點；

(2)sgRNA的合成與提取；

首先合成一段長度為60bp的Oligo片段，其中包括敲除靶點和T7啟動子的序列；然后，以Oligo片段為模板，通過重疊PCR反應合成完整的sgRNA雙鏈模板，長度為130bp，并經酚氯仿提取的方法將sgRNA雙鏈模板提取分離；最后，用T7體外轉錄試劑盒將sgRNA雙鏈模板進行體外轉錄，將轉錄產物提取分離，得到Mdr1a和Mdr1b基因的sgRNA；

(3)sgRNA和Cas9 mRNA共注射與胚胎移植；

將兩種sgRNA與Cas9 mRNA顯微共注射入大鼠受精卵胞漿中；其中，所述sgRNA為Mdr1a和Mdr1b基因的sgRNA；

(4)F0代基因型鑒定；

提取F0代大鼠基因組DNA，并設計引物分別擴增Mdr1a和Mdr1b基因靶點附近序列，連接載體進行測序，鑒定基因突變情況；

(5)F0代繁育與F1代基因型鑒定；

將同時攜帶Mdr1a/1b可用突變的F0代與野生型合籠，將F1代基因組提取后PCR擴增Mdr1a和Mdr1b基因靶點附近序列，進行測序；

(6)F1代繁育與F2代基因型鑒定；

將攜帶Mdr1a/1b可用突變的F1代雌雄個體進行交配，得到F2代，將F2代基因組提取后PCR擴增Mdr1a和Mdr1b基因靶點附近序列，得到Mdr1a/1b基因敲除的個體；

(7)脫靶效應檢測；

根據脫靶效應預測網站，找到針對Mdr1a或Mdr1b的sgRNA所引起脫靶可能性較大的位點，設計引物驗證這些位點是否發生突變。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，其中，Mdr1a基因敲除靶點序列為如SEQ ID NO.1所示的5’-AGATAGCTTTGCAAATGT-3’；Mdr1b基因敲除靶點序列為如SEQ IDNO.2所示的5’-CCTCCTGATGCTGGTGTT-3’。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，其中，包含Mdr1a基因敲除靶點的Oligo片段序列為如SEQ ID NO.3所示的5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGATAGCTTTGCAAATGTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’；包含Mdr1b基因敲除靶點的Oligo片段序列為如SEQ ID NO.4所示的5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGCCTCCTGATGCTGGTGTTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述Mdr1a基因的sgRNA、Mdr1b基因的sgRNA、Cas9 mRNA的濃度比為1-2∶1-2∶1-2；兩種sgRNA與Cas9 mRNA三者混合后每個受精卵注射0.1μL-0.2μL。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7)中，檢測由針對Mdr1a的sgRNA所引起脫靶現象時，所選潛在脫靶位點及所用引物具體信息為：Mdr1a_off_1：上游引物GGTCAAGGCTTTACTCATAT，下游引物TGTAGGACTATAAGTGGTGC，產物長度＝519bp，最佳退火溫度＝56℃；Mdr1a_off_2：上游引物AAACAAGAACTTAGCCACAG，下游引物GTATCCCTTACAAAGCAACA，產物長度＝472bp，最佳退火溫度＝56℃；Mdr1a_off_3：上游引物CTTGGGAAGCATAGCAGACA，下游引物CCATATTCTAAGGCCCATCT，產物長度＝501bp，最佳退火溫度＝56℃；Mdr1a_off_4：上游引物GGCGTACAAAGTGACAAGAT，下游引物TCAAAGGAATGAAGACTGAAAT，產物長度＝503bp，最佳退火溫度＝53℃。