[發明專利]檢測Kras基因第12、13密碼子突變位點的方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201710769096.1
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107447013B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 徐曉晶;趙瑩;姚琴琴;陸凌佳;賀華
• 申請（專利權）人: 上海伯豪生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

本發明公開了一種檢測Kras基因第12、13密碼子突變位點的方法及其試劑盒，該方法包括步驟：1)提取樣本DNA，作為DNA模板；2)利用一組ARMS引物，其上游引物選自SEQ ID NO.1?8所示序列的任意一種，其下游引物為如SEQ ID NO.9所示序列；如SEQ ID NO.17所示的熒光探針和如SEQ ID NO.18所示的封閉探針，對DNA模板進行熒光PCR擴增；3)檢測熒光PCR擴增中的反應體系的熒光強度，并根據熒光強度達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值來判斷Kras基因第12、13密碼子突變位點的突變。該試劑盒包括：上述ARMS引物、熒光探針和封閉探針。本發明能克服現有測序技術低通量、耗時長、檢測能力有限等缺點，且具有快速、通量高、靈敏度高、特異性好等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種檢測Kras基因第12、13密碼子突變位點的試劑盒。本試劑盒用于石蠟包埋病理組織樣本中對人類KRAS基因12號密碼子和13號密碼子上7種常見突變的定性檢測。此外，本發明還涉及一種檢測Kras基因第12、13密碼子突變位點的方法。

背景技術

KRAS是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體，是RAS基因家族成員之一，該基因編碼的蛋白質與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴散以及血管生成均有關系。KRAS基因在各種腫瘤中突變概率很高，常見突變位點為KRAS基因2號外顯子的12號密碼子和13號密碼子，最常見的7個突變熱點為：G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D，這7種突變占到了所有突變的98.5％以上。

KRAS基因突變狀態直接影響EGFR(表皮生長因子)靶向治療藥物的療效。KRAS基因野生型患者能從此類藥物治療中獲益，而KRAS基因突變的結直腸癌患者治療效果較差。歐洲藥監局和美國FDA明確規定了在使用靶向藥物治療轉移性大腸癌患者前必須檢測KRAS基因的基因型。中國衛生部公布的《結直腸癌診療規范(2010年版)》也規定轉移性結直腸癌患者在接受EGFR靶向藥物之前須進行KRAS突變檢測。

目前，Kras突變檢測技術主要有測序技術和定量PCR技術兩大類：測序技術中包含一代測序即sanger測序技術和新一代測序技術也稱為二代測序技術。其中一代測序技術一般一次只能檢測一個位點一個樣本，檢測通量低且耗時長，并且一代測序只能準確檢測某個基因位點純合(100％)或雜合突變(50％)的突變比例；而二代測序技術，檢測通量高，但是檢測前有復雜的樣本處理及測序文庫建立過程，檢測后有復雜的生物信息學分析過程，整個檢測周期很長，且一般5％-10％以下的突變比例檢測如果測序深度不夠，會影響檢測結果準確性，如果加大測序深度，則二代測序成本會提高很多。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種檢測Kras基因第12、13密碼子突變位點的方法及其試劑盒。該方法是基于優選擴增反應引物、熒光探針和封閉探針(block探針)的ARMS-qPCR系統的熒光PCR檢測方法，其能克服現有一代測序技術低通量、耗時長、檢測能力有限的問題，也可以克服二代測序操作繁瑣、分析復雜、成本高等缺點。進一步地，由于KRAS基因突變位點與野生型僅有一個堿基差異，易造成檢出假陽性以及位點之間的交叉反應，本試劑盒采用了封閉探針的方法。因此本試劑盒具有高效、快速、準確性高、靈敏度高、成本低等優點。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

在本發明的一方面，提供一種檢測Kras基因第12、13密碼子突變位點的方法，包括以下步驟：

1)提取樣本DNA，將其作為DNA模板；

2)利用一組ARMS引物，一個如SEQ ID NO.17所示的熒光探針(特異性雙環分子信標熒光探針)和一個如SEQ ID NO.18所示的封閉探針，對步驟1)的DNA模板進行熒光PCR擴增(即進行熒光PCR擴增突變基因序列)；所述一組ARMS引物的上游引物選自SEQ IDNO.1-8所示序列的任意一種，其下游引物為如SEQ ID NO.9所示序列；