[發明專利]一種軟骨細胞凍存保護液及其應用和軟骨細胞凍存方法

有效

• 申請號: 201710765053.6
• 申請日: 2017-08-30
• 公開（公告）號: CN107372466B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 陳海佳;葛嘯虎;王一飛;梁美樂;王小燕
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛;趙青朵

本發明涉及醫學領域，公開了一種軟骨細胞凍存保護液及其應用和軟骨細胞凍存方法。本發明所述凍存保護液包括DMSO、胎牛血清和臍帶間充質干細胞生長因子；所述臍帶間充質干細胞生長因子為臍帶間充質干細胞經1640培養基培養后的培養基上清液凍干粉。本發明以DMSO、胎牛血清和臍帶間充質干細胞生長因子作為凍存保護液的組分，通過各組分的相互作用，可有效保護軟骨細胞凍存，并在復蘇后維持軟骨細胞回收率和存活率在較高水平，同時提高細胞增殖能力，顯著優于同類保護液。

技術領域

本發明涉及醫學領域，具體的說是涉及一種軟骨細胞凍存保護液及其應用和軟骨細胞凍存方法。

背景技術

軟骨細胞是在軟骨發現的唯一一種細胞。軟骨細胞主要作用是生成和維持軟骨基質，關節軟骨損傷后主要由軟骨細胞增殖分化來修復。組織工程技術是最近20年新起的一門科學，在軟骨缺損修復方面有很多成功的報道。其中軟骨細胞的保存是組織工程技術中重要的環節，軟骨細胞的增殖能力極有限，其凍存后的質與量直接影響修復作用。

目前的軟骨細胞凍存保護液，要么成分復雜，配制麻煩，要么凍存效果不理想。現在較為簡單的凍存液配方主要有兩類：1、DMSO+血清；2、完全培養基+DMSO+血清，而其他類型的凍存保護液多為在此兩種配方的基礎上添加其他保護細胞的物質，但是這些保護液的凍存效果并不滿意。

中國專利CN105850979A公開了一種骨髓間充質干細胞的凍存保護液及凍存方法，其采用DMSO+胎牛血清+骨髓間充質干細胞條件培養基組成凍存保護液進行保護，能夠使骨髓間充質干細胞凍存復蘇后細胞回收率和活力較高。然而，將該專利的凍存液應用于軟骨細胞的凍存中發現，軟骨細胞的回收率和存活率明顯較差。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種軟骨細胞凍存保護液，使得所述凍存保護液能夠顯著提高入骨細胞凍存復蘇后的細胞回收率、細胞存活率和細胞增殖能力，同時基于該凍存保護液本發明提供了一種軟骨細胞的凍存方法。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種軟骨細胞凍存保護液，包括DMSO、胎牛血清和臍帶間充質干細胞生長因子；做為優選，所述凍存保護液由DMSO、胎牛血清和臍帶間充質干細胞生長因子；所述臍帶間充質干細胞生長因子為臍帶間充質干細胞經1640培養基培養后的培養基上清液凍干粉。

針對現有軟骨細胞凍存保護液保護效果不理想的問題，本發明將DMSO、胎牛血清和臍帶間充質干細胞生長因子作為保護液的有效成分，通過各組分的共同作用，實現了軟骨細胞凍存復蘇后細胞活率和回收率保持在較高水平的目的，同時提高了細胞增殖能力。

作為優選，所述凍存保護液中DMSO和胎牛血清的體積比為(1-2):(8-9)；在具體實施方式中，所述凍存保護液中DMSO和胎牛血清的體積比為1:9或1:4，兩者上述配比均可以轉換成任何形式，只要符合比例即可。

作為優選，所述凍存保護液中臍帶間充質干細胞生長因子的濃度為1-2mg/mL。

本發明在具體實施方式中還提供了所述臍帶間充質干細胞生長因子由具體制備方法，如下：

取P1-P5代的臍帶間充質干細胞擴繁，用低糖DMEM+10％FBS培養細胞，3天一換液，至細胞生長融合度達80％以上時，換用1640培養基培養，每天收集培養細胞的培養基，連續收集三天，通過濾膜過濾濃縮同時除去顆粒物質，濾液濃縮至蛋白質濃度為1000mg/L時凍干，獲得生長因子。