[發明專利]用于表達限制性內切酶FspI的甲基化保護菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 201710765015.0
• 申請日: 2017-08-30
• 公開（公告）號: CN107760697A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 張坤曉;韓挺翰;龔雪梅;許恒皓
• 申請（專利權）人: 江蘇愚公生命科技有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所32255
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及一種菌株的篩選方法，特別是一種用于表達限制性內切酶FspI的甲基化保護菌株的篩選方法。

背景技術

限制性內切酶是可以識別雙鏈DNA序列特異序列并進行切割的核酸酶(Ch.8,eds.De Bruijin,et al., Chapman & Hall, New York,78-92.1998)，其發現促使DNA重組技術的誕生從而極大推動現代分子生物學和基因工程的發展，是當代基因工程研究不可或缺的基礎工具。在細菌中，限制性內切酶及其相應的甲基轉移酶構成限制-修飾系統，以保護微生物不受外來噬菌體的侵染或質粒。同一系統的限制性內切酶和甲基轉移酶在DNA上有相同的識別序列，但作用不同，限制性內切酶切割非甲基化的識別序列，甲基轉移酶在識別序列上的特異性修飾可防止限制性內切酶的切割。限制-修飾基因常緊密連鎖，細菌通過調控兩者的表達，使自身DNA首先受到甲基化保護,保護完成后再表達限制酶，而入侵的異源DNA并沒有受到保護因而被限制性內切酶降解。即胞內相關的甲基轉移酶對與其配對限制性內切酶識別的相同特定序列進行甲基化修飾，并使修飾的DNA具有抵抗其限制性內切酶的切割的特性，保護宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA(Geoffery G.W.,Nucleic Acids Res,2539-2564.1991)。

關于限制-修飾系統在原核細胞中表達的研究表明,系統的建立和維持是以甲基轉移酶的保護作用為前提。基于DNA分子的結構組成和特性，自然界中主要存在三類DNA甲基轉移酶，分別是C⁵胞嘧啶甲基酶、N⁴胞嘧啶甲基酶和N⁶腺嘌呤甲基酶。其中，N⁴胞嘧啶和N⁶腺嘌呤甲基酶屬于氨基-甲基轉移酶(Malone et al. J.Mol. Biol. 253:618-632.1995)。當一個有限制酶識別位點的DNA被甲基轉移酶修飾后，這個DNA分子就會具有抵抗相應限制酶的酶切的特性。即通常情況下，如果DNA識別序列相同(或識別序列包含在內)并且甲基化酶修飾位點和方式也一致，那么這種經過甲基轉移酶特異性甲基化修飾的DNA就具有可以抵抗相似識別序列的限制性內切酶切割的作用，從而保護宿主細胞的DNA免受破壞。例如EagI的識別序列是5’CGGCCG3’,包含在NotI的識別序列之中(5’GCGGCCGC3’)，而且其甲基化位點和修飾方式一致(C⁵胞嘧啶甲基酶)，因而可以通過在宿主菌內表達M. EagI來抵抗限制酶NotI對DNA的酶切。

自20世紀60年代末第一個限制性內切酶被發現之后，越來越多的限制性內切酶被發現、提純并獲得應用。關于限制性內切酶的研究,多年來著重于它們作為工具酶的實用價值,包括新酶的發現與篩選、高產工程菌株的構建、酶純化技術與程序的優化改進等。其中FspI是一種應用較為廣泛的限制性內切酶，可識別六個堿基的核酸序列(5’TGCGCA3’)，不僅可作為普通的限制性內切酶應用于分子克隆，在生物領域的其他方向也具有重要的應用價值及研究潛力。但由于表達量低、分離純化程序繁瑣、蛋白得率低等問題，目前市售的FspI限制酶不僅價格高，而且也限制了它的廣泛應用及深入研究。同時，以上提及的一系列問題也限制了其他很多應用廣泛的限制性內切酶的深入研究。

限制性內切酶具有能夠切割DNA的特性，一旦表達將切割宿主細胞DNA，造成宿主細胞的損傷甚至死亡。因此，必須對宿主細胞的DNA進行特異性的甲基化修飾后才能實現其重組表達。現有技術一的方案中，利用了FspI對應的天然特異性甲基轉移酶M.FspI進行宿主DNA的保護。具體步驟包括：提取天然來源菌株 Fischerella species 染色體DNA并制備DNA文庫；利用M.FspI保護DNA不被FspI切割的特性，從文庫中篩選出M.FspI基因；將帶有M.FspI基因的質粒轉化進入表達宿主工程菌株中。在獲得DNA受到甲基化保護的表達宿主工程菌株后，將FspI限制酶基因構建于表達載體，轉化進入上述菌株，誘導FspI的重組表達。表達后的純化步驟涉及鎳基質的親和層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、肝素瓊脂糖親和層和凝膠分子排阻等層析純化過程。其缺點在于：對宿主細胞DNA的甲基化保護在通過繁瑣的DNA文庫構建和篩選后，所獲得的甲基化保護菌株只能特異性保護DNA免于FspI限制酶的切割，少有能用于其他限制酶的表達，應用范圍極為狹窄。

發明內容