[發明專利]甲酸脫氫酶工程菌株的構建方法及應用有效
| 申請號： | 201710763804.0 | 申請日： | 2017-08-30 |
| 公開（公告）號： | CN107299074B | 公開（公告）日： | 2020-06-16 |
| 發明（設計）人： | 張強;季蕾;王加寧;傅曉文;李天元;陳貫虹 | 申請（專利權）人： | 山東省科學院生態研究所 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;A62D3/02;C12R1/19;A62D101/20 |
| 代理公司： | 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219 | 代理人： | 朱家富 |
| 地址： | 250014 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 甲酸 脫氫酶 工程 菌株 構建 方法 應用 | ||
1.甲酸脫氫酶工程菌株的構建方法，其特征在于，步驟如下：
（1）提取博伊丁假絲酵母基因組DNA為模板；
所述博伊丁假絲酵母（
（2）以步驟（1）制得的基因組DNA為模板，以兼并引物進行PCR擴增，兼并引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，兼并引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，制得fdh基因片段；
（3）將步驟（2）制得的fdh基因片段用內切酶XbaI和BamHI雙酶切fdh基因和質粒pET28a（+），再用連接酶連接，得到質粒pET28a(+)-fdh；
（4）將質粒pET28a(+)-fdh轉化進大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂布篩選平板，37℃培養24h后進行克隆子鑒定，選取陽性菌株，得到表達fdh的重組菌株BL21(DE3)-fdh。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟（2）中，PCR擴增條件為：94℃預變性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30 循環；72℃延伸7min。
3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟（2）中，PCR擴增體系如下，總體系50μL：
dNTP 5μL，上游引物 1μL，下游引物 1μL；模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，Buffer5μL，加雙蒸水至50μL。
4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟（4）中，篩選平板組分如下，均為質量百分比：
1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母提取物，2％瓊脂，100μg/mL 卡那霉素，余量為水。
5.權利要求1所述構建方法構建的甲酸脫氫酶工程菌株在多環芳烴降解過程中的應用。
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