[發(fā)明專利]一種圓褐固氮菌及其鑒定方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710760773.3
• 申請日: 2017-08-30
• 公開（公告）號: CN109423456B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊帆;顧磊;許科偉;高俊陽;湯玉平;盧麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國石油化工股份有限公司;中國石油化工股份有限公司石油勘探開發(fā)研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/64;C12Q1/04;C12R1/065
• 代理公司: 北京聿宏知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;桑勝梅

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域的一種圓褐固氮菌及其鑒定方法和應(yīng)用。該圓褐固氮菌16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，菌株為SINOPEC12，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為CCTCC NO：M2016110。該菌株在油氣藏上方土壤中的豐度與油氣藏上浮氣態(tài)烴濃度呈正相關(guān)，可用作油氣微生物，指示油氣藏上方烴類滲漏高值區(qū)域。同時，該菌株在油氣藏上方土壤中的豐度較高，無需擴(kuò)增培養(yǎng)，通過改進(jìn)的引物即可對土壤中的圓褐固氮菌SINOPEC12的16S rDNA保守序列進(jìn)行擴(kuò)增，可準(zhǔn)確、高效地判斷油氣藏上浮氣態(tài)烴的濃度，解決了傳統(tǒng)生理生化檢測周期長，對樣品培養(yǎng)物純度要求高的不足。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種圓褐固氮菌及其鑒定方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物勘探技術(shù)的核心是油氣指示微生物的鑒定。通常情況下勘探過程中所研究的目標(biāo)微生物在環(huán)境中的相對豐度很低，因此需在傳統(tǒng)的特異培養(yǎng)條件下刺激油氣藏環(huán)境與非油氣藏環(huán)境中烴類氧化細(xì)菌的快速繁殖。上述方法雖然可以獲得微生物的數(shù)量信息，但是該數(shù)量信息事實上成幾何倍數(shù)地高于原位環(huán)境中的微生物數(shù)量，不可避免地掩蓋了油氣藏與非油氣藏環(huán)境中微生物數(shù)量上的差異，同時也無法獲得不可培養(yǎng)微生物的信息。另外，油氣微生物的生長除受烴類影響，還會受到周圍環(huán)境的影響，如土壤的濕度、pH值、鹽度或其中的關(guān)鍵離子、營養(yǎng)物質(zhì)和擾動等。若微生物發(fā)育的相對強(qiáng)弱是由環(huán)境因素所引起，則會造成油氣富集或貧乏的假象。

圓褐固氮菌屬于細(xì)菌，菌體桿狀、卵圓形或球形，無內(nèi)生芽孢，革蘭氏染色陰性，嚴(yán)格好氧、有機(jī)營養(yǎng)型，能固定空氣中的氮素。包括固氮菌屬、氮單孢菌屬、拜耶林克氏菌屬和德克斯氏菌屬。在普光氣田油氣藏上方土壤中發(fā)現(xiàn)該菌占較大的豐度，為了進(jìn)一步確定該菌與油氣微生物勘探之間的關(guān)系，需對其典型菌株的獲取及檢測技術(shù)進(jìn)行開發(fā)研究。

目前，圓褐固氮菌的常見檢測鑒定方法有兩種：1.生理生化鑒定，通過分離出的純菌，對微生物生理生化進(jìn)行定性研究，該方法周期長且對培養(yǎng)物純度提出較高的要求；2.基因提取后進(jìn)行16SrDNA的測序，該方法仍需獲取純培養(yǎng)物進(jìn)行全基因提取，再通過通用16SrDNA引物獲取保守序列進(jìn)行測序。

因此，為了能夠快速、準(zhǔn)確獲取油氣田上方土壤中圓褐固氮菌的特征信息，急需對其典型菌株的獲取及混合體系中的檢測技術(shù)進(jìn)行開發(fā)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供了一種圓褐固氮菌及其鑒定方法，該菌株在油氣藏上方土壤中的豐度較高，且所述圓褐固氮菌在油氣藏上方土壤中的豐度與油氣藏上浮氣態(tài)烴濃度呈正相關(guān)，因此該菌株可用作油氣微生物，指示油氣藏上方烴類滲漏高值區(qū)域。

本發(fā)明還提供了一種利用所述圓褐固氮菌指示油氣藏上浮氣態(tài)烴濃度的方法，該方法采用改進(jìn)的引物對所述圓褐固氮菌的16SrDNA保守序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目標(biāo)條帶的亮度，可準(zhǔn)確、高效地判斷油氣藏上浮氣態(tài)烴的濃度。

為此，本發(fā)明第一方面提供了一種圓褐固氮菌，其16SrDNA的基因序列如 SEQ IDNO.1所示。

根據(jù)本發(fā)明，所述圓褐固氮菌的菌株為SINOPEC12，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為CCTCC NO：M2016110。

根據(jù)本發(fā)明，所述圓褐固氮菌的生物學(xué)特征為：在固體培養(yǎng)基上的菌落呈圓形、半透明、表面光滑、中間凸起、粘稠狀，顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)呈桿狀、周生鞭毛、有莢膜，革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性。

本發(fā)明中，所述的固體培養(yǎng)基為甲醇固體培養(yǎng)基或丁醇固體培養(yǎng)基；具體地，所述的甲醇固體培養(yǎng)基的組成如下(1L去離子水中)：

和/或，所述的丁醇固體培養(yǎng)基的組成如下(1L去離子水中)：