[發明專利]一種從酵母中提取和分離純化甘露糖寡糖的方法

有效

• 申請號: 201710760135.1
• 申請日: 2017-08-30
• 公開（公告）號: CN107459537B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 劉一江;陳懷俊;陳國頌
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07H3/06
• 分類號: C07H3/06;C07H1/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;王潔平

本發明公開了一種從酵母中提取和分離純化甘露糖寡糖的方法。其具體步驟如下：（1）以酵母為原料，以乙酸酐為介質，利用濃硫酸進行酸解；（2）酸解粗產物用二氯甲烷溶解提取，得到提取后粗產物；（3）將提取后粗產物反復重沉淀和重結晶，進行精煉；（4）利用柱層析分離與純化得到全乙酰保護甘露糖寡糖；（5）堿性條件下，脫保護全乙酰保護甘露糖寡糖，得到甘露糖寡糖，甘露糖寡糖是甘露糖三糖（Manα1?2Manα1?2Man）和甘露糖四糖（Manα1?3Manα1?2Manα1?2Man）。本發明方法簡單，能有效提高甘露糖寡糖的制備效率，并降低成本。

技術領域

本發明涉及糖分離純化技術領域，具體的說，涉及一種從酵母中提取和分離純化甘露糖寡糖的方法。

背景技術

寡聚甘露糖是一種常見的多糖，廣泛的存在于自然界中各種病原微生物如細菌、真菌、病毒的表面。生物體免疫系統中廣泛存在的甘露糖結合凝集素（Mannose-bindinglectin, MBL）可與這類病原微生物表面的甘露糖殘基相結合，在生物體的固有免疫應答中發揮重要的作用。

人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）自其發現以來，已成為現代人類健康的重大威脅之一。近年來的研究發現，HIV衣殼gp120表面表達有大量特定結構的寡聚甘露糖Man₉(GlcNAc)₂，結構如式1所示。大量研究顯示，Man₉(GlcNAc)₂中Manα1-2Man甘露糖殘基可與人體中HIV-1中和抗體2G12特異性結合，其可能刺激人體中類2G12型抗體的免疫響應，有望成為一種HIV疫苗設計的新方向。

式1

隨著近年來HIV疫苗研究的推進，以及其他糖生物學以及免疫學研究的開展，對特定結構寡聚甘露糖及其衍生物有著越來越多的需求。由于特定結構多糖化學合成步驟繁多，純化困難，產量通常僅為毫克級，極大限制了其推廣和應用；生物發酵或天然產物提取可以獲得雖然有較高的產率，但由于分離純化困難，較難獲得高純度且具有精確結構的多糖。其中Manα1-2Man寡聚甘露糖及其衍生物由于其結構特殊，大多僅限于少量的實驗室合成，其商業產品在國內外多糖試劑市場依然為空白。因此，尋找Manα1-2Man寡聚甘露糖簡單可靠的制備純化方法，對目前糖生物學以及免疫相關研究的開展有著重要的意義，并具有十分廣闊的商業前景。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種從酵母中提取和分離純化高純度的甘露糖寡糖的方法，其反應裝置簡易、操作簡單，同時所得產物具有較高純度。

本發明的技術方案具體介紹如下。

本發明提供一種從酵母中提取和分離純化甘露糖寡糖的方法，具體步驟如下：

（1）以酵母為原料，以乙酸酐為介質，利用濃硫酸進行酸解，得到酸解粗產物；

（2）酸解粗產物用二氯甲烷溶解提取，采用在分液漏斗中靜置分層的方法來分離溶解有粗產物的二氯甲烷和固體不溶物，溶有粗產物的二氯甲烷可直接從漏斗下端放出，上層的不溶部分棄去，溶液部分洗滌、濃縮、干燥，得到提取后粗產物；

（3）將提取后粗產物采用乙酸乙酯和石油醚混合體系反復重沉淀和重結晶，除去不溶于乙酸乙酯和石油醚的多糖和全乙酰保護的甘露單糖，進行精煉；

（4）利用柱層析分離與純化該全乙酰保護甘露糖寡糖的混合物，得到全乙酰基保護的甘露三糖和全乙酰基保護的甘露四糖；

（5）堿性條件下，將全乙酰保護甘露糖寡糖脫保護，分別得到甘露三糖（Manα1-2Manα1-2Man）和甘露四糖（Manα1-3Manα1-2Manα1-2Man）。

本發明中，步驟（1）中，酵母為高糖型酵母。