[發明專利]一種基于細菌增長對細菌快速鏡檢的方法

有效

• 申請號: 201710757047.6
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107656056B
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 張鴻雁;劉兆臣;杜淑媛
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明設計并建立了一種基于細菌增長的用于鏡檢檢測大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌的新方法。通過向待測樣品溶液中添加β?內酰胺類抗生素使得細菌菌體增長，并聯合膜過濾與磁分離實現對大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌的特異性與高靈敏度檢測，使得細菌數目在光學顯微鏡下即可得到判斷，該方法可以應用到水樣中，整個檢測過程可在2小時內完成。經試驗驗證，本發明方法對大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌兩種細菌的檢測限均可低至5個細胞，可以滿足快速檢測方法的要求。該方法操作簡單，成本低，可廣泛應用于實際樣品中對革蘭氏陰性菌的鏡檢檢測中。

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，特別涉及一種基于細菌增長對細菌快速鏡檢的方法。

背景技術

由微生物引起的食品污染以及食源性疾病極大地威脅了公眾的健康與食品行業的發展。全世界范圍內，每年由食源性致病菌如大腸桿菌和沙門氏菌所引發的疾病危害極為嚴重。甚至很低的感染劑量都會導致嚴重的疾病。比如大腸桿菌與沙門氏菌的感染劑量可低至10個細胞。因此建立有效的檢測方法檢測細菌的數目尤為重要。

傳統的平板培養方法是當前細菌檢測的國家標準方法，但是該方法操作繁瑣，耗時較長，無法滿足快速檢測的要求。酶聯免疫吸附試驗，聚合酶鏈式反應以及表面增強拉曼光譜等檢測方法具有靈敏度高，快速，特異性強等優點，但是儀器操作較復雜，花費成本比較高，需要復雜的樣品處理過程。不適用于現場檢測。而且當細胞數量低于100時，快速檢測方法的準確度不高。顯微鏡觀察是比較直觀的方法，能從視覺上判斷細菌的數目。該方法操作簡單，成本花費較少，不需復雜的樣品處理過程。但是細菌長度一般小于5μm，難以清晰地將其與雜質分辨。因此建立一種基于顯微鏡的檢測方法以實現在單細胞水平上對細菌的快速檢測成為本領域亟待解決的問題。

發明內容

β-內酰胺類抗生素可以通過抑制或誘導青霉素結合蛋白(penicillin bindingproteins,PBPs)產生突變，影響細胞壁中肽聚糖的聚合作用，使細菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解。基于此，發明人在研究中發現，通過抗生素的適當處理，革蘭氏陰性菌的細胞分裂過程被抑制，但是細胞長度會一直增加呈絲狀直到細胞溶解，而在此過程中，增長后的細菌可以在顯微鏡下清晰地看到。基于此，發明人提出一種基于細菌增長實現對細菌快速鏡檢的方法，該方法操作簡單，耗時短，靈敏性高，特異性好，不需要昂貴復雜設備，成本低廉，適于對細菌鏡檢的實際應用。

具體的，本發明涉及以下技術方案：

本發明的第一個方面，公開了β-內酰胺類抗生素在細菌快速鏡檢中的應用。

其中，β-內酰胺類抗生素包括但不限于青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環類、碳青霉烯類和青霉烯類酶抑制劑，優選的，所述β-內酰胺類抗生素包括頭孢氨芐，氨曲南和阿莫西林；更進一步優選的，所述β-內酰胺類抗生素為氨曲南，所述氨曲南添加濃度為1～100倍最小抑菌濃度(優選為1倍最小抑菌濃度)；試驗表明，氨曲南在1倍最小抑菌濃度時可最大程度上引起大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌菌體增長，而不致使待測菌體快速溶解，有利于后續鏡檢；

所述細菌為革蘭氏陰性菌，進一步的，所述細菌為大腸桿菌和/或鼠傷寒沙門氏菌；

所述應用具體方法為：將β-內酰胺類抗生素添加至待測細菌中，促使細菌菌體伸長，便于在顯微鏡下鏡檢觀察。

進一步的，所述應用具體方法為：將氨曲南以終濃度為1倍最小抑菌濃度添加至大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌菌液中。

本發明的第二個方面，公開了一種基于細菌增長對細菌快速鏡檢的方法，具體包括步驟如下：

S1.向待測樣品中添加β-內酰胺類抗生素和抗體修飾磁球進行孵育處理，其中，β-內酰胺類抗生素促使待測細菌菌體伸長，便于后續在顯微鏡下鏡檢觀察；抗體修飾磁球與伸長后的細菌偶聯；