[發(fā)明專利]一種用于檢測雞白痢沙門氏菌的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710756858.4
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107513563B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于申業(yè);劉思國;曹俊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一種用于檢測雞白痢沙門氏菌的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括用于檢測雞白痢沙門氏菌的特異性引物以及SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增緩沖液，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDN O.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包括陽性對照以及陰性對照。

3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的陽性對照為雞白痢沙門氏菌菌株的基因組DNA或是含有SEQ ID NO.1所示序列的載體；所述的陰性對照為無菌水。

4.如權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于用于檢測雞白痢沙門氏菌時包括以下步驟：

步驟一，提取待檢樣品基因組DNA，使用權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增；

步驟二，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷樣品是否含有雞白痢沙門氏菌，所述判斷具體為：Ct值≤35且熔解溫度為79.5℃，則說明樣品中含有雞白痢沙門氏菌；Ct值在35～40之間但熔解溫度不是79.5℃，則樣品中不含有雞白痢沙門氏菌。

5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括在提取待檢樣品基因組DNA之前，使用增菌液對樣本進(jìn)行增菌培養(yǎng)的步驟，所述增菌液為亞硒酸鹽胱氨酸增菌液或RV沙門氏菌增菌液體培養(yǎng)基。

6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，采用高溫裂解法提取待檢樣品基因組DNA。

7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于步驟一中所述PCR擴(kuò)增所采用的檢測體系為25μL反應(yīng)體系包括：2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后滅菌去離子水補(bǔ)足至25μL；所述PCR擴(kuò)增所采用的擴(kuò)增程序為：預(yù)變性95℃，30s；變性95℃，5s，退火59℃，30s，延伸72℃，15s，40個循環(huán)。

8.權(quán)利要求1-7所述的試劑盒在制備檢測雞白痢沙門氏菌試劑中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑用于區(qū)別雞白痢沙門氏菌與其他致病性沙門氏菌血清型以及大腸埃希氏菌。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的其他致病性沙門氏菌血清型包括雞傷寒和腸炎沙門氏菌血清型。