[發(fā)明專利]一種天蠶素B抗菌肽突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710742441.2
• 申請(qǐng)日: 2017-08-25
• 公開（公告）號(hào): CN107459569B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王嘉榕;孫紅賓;趙宏鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C12N15/12;A61K38/17;A61P31/04;A61P35/00;A61P29/00
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 單驍越

本發(fā)明公開了一種天蠶素B抗菌肽突變體及其制備方法和用途。本發(fā)明的抗菌肽對(duì)大腸桿菌、綠膿假單胞菌和枯草芽孢桿菌等具有抑制作用，還能抑制肺癌細(xì)胞的增殖，可用于制備抗菌和肺癌藥物。本發(fā)明的抗菌肽還能有效抑制由脂多糖引起的機(jī)體促炎癥細(xì)胞因子水平升高，可用于開發(fā)抗炎癥藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗菌肽，具體涉及一種含有32個(gè)氨基酸的來(lái)源于中國(guó)橡木蠶蛾抗菌肽天蠶素B的突變體。本發(fā)明同時(shí)還涉及該抗菌肽的基因工程制備方法及其在制備抗菌藥物、抗癌藥物和抗炎癥藥物方面的應(yīng)用，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，濫用抗生素產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，對(duì)人類疾病造成了巨大威脅，作為一個(gè)日益突出的國(guó)際問(wèn)題，將影響到我們的現(xiàn)在和未來(lái)。為了應(yīng)對(duì)耐藥菌感染，人們一方面對(duì)傳統(tǒng)抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以降低細(xì)菌的耐藥性，另一方面也在不斷研究和開發(fā)新型抗菌藥物。近年來(lái)出現(xiàn)的抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)就是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩？咕氖且活愑苫蚓幋a的兩親性小分子多肽，一般由12～100個(gè)氨基酸殘基組成，是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)中一種古老而又重要的組成成分?？咕牡恼娦院蛢捎H性能夠介導(dǎo)其與細(xì)菌細(xì)胞膜表面負(fù)電性物質(zhì)發(fā)生相互作用，并產(chǎn)生跨膜孔道或破壞細(xì)菌胞膜脂質(zhì)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損或死亡。此外，抗菌肽也可穿過(guò)細(xì)菌胞膜，通過(guò)抑制某種蛋白質(zhì)、核酸的合成，使細(xì)胞死亡。

對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌而言，脂多糖是其細(xì)胞壁的主要組成部分，它能提供細(xì)菌以結(jié)構(gòu)的完整性，并保護(hù)細(xì)菌膜免受某些化學(xué)物質(zhì)的攻擊。脂多糖被稱之為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌主要致病成分，可引起強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，導(dǎo)致幾乎所有的真核細(xì)胞發(fā)生形態(tài)、代謝和基因表達(dá)變化，刺激宿主細(xì)胞因子失控性表達(dá)，發(fā)生嚴(yán)重感染(Schulte等,2013,MediatorsInflamm.2013:165974)。已報(bào)道有多種抗菌肽可中和脂多糖的細(xì)胞毒性(Ding等,2003,Biochemistry.42(42):12251-12559)，抑制單核巨噬細(xì)胞活化、降低促炎細(xì)胞因子生成，并充當(dāng)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞趨化因子，使其快速聚集于炎癥反應(yīng)部位，從而盡快消除炎癥，抗菌肽的這一顯著特性使其成為新一代抗感染制劑的新星。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種抗菌肽，其來(lái)源于一種名為Antheraea pernyi的中國(guó)橡木蠶蛾所分泌的抗菌肽天蠶素B，該天蠶素B含有35個(gè)氨基酸。發(fā)明人將其鉸鏈區(qū)的3個(gè)氨基酸AGP去除，從而得到了本發(fā)明的抗菌肽(KL32)，其氨基酸序列如下所示：

KWKIFKKIEKVGRNIRNGIIKAVAVLGEAKAL(SEQ ID NO.1)。

本發(fā)明還提供一種核酸，其編碼本發(fā)明的天蠶素B抗菌肽突變體。

本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體為表達(dá)載體，更優(yōu)選為原核表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的載體或本發(fā)明的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。

本發(fā)明還提供一種制備KL32的方法，所述方法包括將所述KL32的編碼基因與所述表達(dá)載體可操作性的連接，得到重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，收集并純化表達(dá)的目的蛋白。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括將Sumo標(biāo)簽基因(Sumo標(biāo)簽基因N端有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽)和編碼所述KL32的核酸序列依次連接在一起。將該基因與表達(dá)載體可操作性的相連接，得到重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)細(xì)胞，培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，收集并純化所表達(dá)的蛋白，利用Sumo酶切割Sumo標(biāo)簽，并進(jìn)行反向高效液相色譜從而純化KL32。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)于本發(fā)明所述的突變體，誘導(dǎo)表達(dá)條件為：37℃培養(yǎng)細(xì)胞到OD₆₀₀達(dá)到0.6時(shí)加入終濃度為0.5mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。