[發明專利]一種檢測雞WNT9A基因表達量的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201710737096.3
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107287344A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 吳鵬飛;張跟喜;張濤;邱聰;婁秋宏;袁曼曼;戴國俊;謝愷舟;王金玉
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種檢測雞WNT9A基因表達量的試劑盒及檢測方法。

背景技術

基因表達是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA序列中遺傳信息經過轉錄和翻譯，轉變成有生物活性的蛋白質分子的過程。基因表達規律的研究，可以了解到目的基因在不同組織器官中的表達情況，為進一步分析該基因的功能提供幫助。雖然在基因表達過程中還有翻譯和翻譯后的加工過程，但是mRNA是轉錄起始在基因表達的基本控制點，因此基因mRNA表達水平的測定能夠較好的反應基因表達水平和生物學功能的強弱。本課題組前期轉錄組研究發現，在生長速度快慢的兩種不同京海黃雞個體中，WNT9A基因為腿肌組織中的差異表達基因。WNT9A基因為WNT家族成員之一，WNT家族通過分泌性蛋白WNTS作用于多種不同受體從而轉導不同的細胞內信號通路，WNTS可通過激活多種細胞內信號通路來調控多種細胞功能，包括細胞的增殖、分化、凋亡、存活、遷移能力和細胞極性等，因此該家族每一個成員缺一不可。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種檢測雞WNT9A基因表達量的試劑盒，該試劑盒可對雞WNT9A基因表達量進行測定，研究WNT9A基因在雞各種組織中的表達規律。

本發明的原理是：提取京海黃雞組織總RNA進行反轉錄，得到cDNA。利用設計的擴增目的基因和內參基因的特異引物進行熒光定量PCR。結果表明目的基因和內參基因的溶解曲線上只有單峰的存在，說明引物的特異性良好，三對引物都沒有非特異性擴增和引物二聚體的形成，可用于熒光定量PCR。繪制的標準曲線表明，目的基因和內參基因標準曲線的斜率基本一致，即擴增效率基本一致，可運用2^-△△CT方法對相對表達量進行分析。

本發明公開了用于上述方法的試劑盒，該試劑盒由特異性引物、2×濃度的Premix試劑、50×濃度的ROX Reference Dye II和滅菌水組成，其中所述的特異性引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

提取待測樣本的組織總RNA進行反轉錄后，利用該試劑盒進行熒光定量PCR，運用2^-△△CT方法對相對表達量進行分析,具體計算公式:△△Ct＝(待測組目的基因平均Ct值－待測組看家基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值－對照組看家基因平均Ct值)。其中，Ct值(初始循環數)為熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閩值所對應的循環次數。

一種檢測雞WNT9A基因表達量的方法，是提取待測樣本的組織總RNA進行反轉錄后，利用本發明試劑盒進行熒光定量PCR，運用2^-△△CT方法對相對表達量進行分析。

用本發明的試劑盒選擇的檢測方法簡單快捷，可對雞WNT9A基因表達量進行測定，研究WNT9A基因在雞各種組織中的表達規律。

附圖說明

圖1組織總RNA的提取結果。圖中M指的是Marker DL2000；1、2、3和4分別是心、肝、脾和肺組織RNA；bp表示堿基對數。

圖2是WNT9A基因的溶解曲線。

圖3是β-actin基因的溶解曲線。

圖4是GAPDH基因的溶解曲線。

圖5是WNT9A基因的標準曲線。

圖6是β-actin基因的標準曲線。

圖7是GAPDH基因的標準曲線。

具體實施方式

實施例1

1.待測組織RNA的提取和反轉錄

實驗采用來自京海禽業集團有限公司的飼養管理水平一致的京海黃雞。選取3只12周齡體重相近的母雞進行屠宰，采集心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、卵巢組織樣，RNA Wait樣品保存液浸潤后-70℃保存備用。

2.反轉錄

反轉錄體系為40ul(冰上配制)，具體操作為，在0.2m1的PCR管中加入5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)8u1，加入約2000ng量的RNA模板(根據已經提取的各組織RNA濃度計算)，加入RNase Free dH₂0補全至40u1.

將加好試劑的PCR管瞬時離心后放在PCR儀上進行反應。反轉錄條件如下：

37℃15min(反轉錄反應)

85℃5sec(反轉錄酶的失活反應)

4℃

所得產物即為cDNA，-20℃保存備用