[發明專利]異位表達的載體及其在提高植物營養組織油含量的應用有效

申請號：	201710735897.6	申請日：	2017-08-24
公開（公告）號：	CN107523585B	公開（公告）日：	2020-12-22
發明（設計）人：	牛蕾蕾;雷潔;鄭志富;甘毅;陳亞東;薛金嫚;劉宏波	申請（專利權）人：	浙江農林大學
主分類號：	C12N15/82	分類號：	C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82;A01H6/54;A01H6/20;A01H6/14;A01H6/46
代理公司：	洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120	代理人：	張隨
地址：	311300 浙江省***	國省代碼：	浙江;33
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摘要：
搜索關鍵詞：	表達載體及其提高植物營養組織含量應用
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【權利要求書】：

1.在植物營養組織中異位表達的載體，其特征在于：所述載體引入以下模塊：

調控油脂合成的四種目的基因LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1中的至少三種；

控制目的基因均衡表達的轉錄單元；

多克隆位點。

2.如權利要求1所述的在植物組織中異位表達的載體，其特征在于：所述載體為含有LEC2、DGAT1、OLEO2和GAT1基因組合的載體。

3.如權利要求1或2所述的在植物營養組織中異位表達的載體，其特征在于：所述載體中啟動LEC2基因表達的啟動子為35S，終止該基因表達的終止子為NOS；啟動DGAT1基因表達的啟動子為35S，終止該基因表達的終止子為At4g25710 基因的3’UTR；啟動OLEO2基因表達的啟動子為At4g25700基因的啟動子，終止該基因表達的終止子為NOS；啟動GAT1基因表達的啟動子為35S，終止該基因表達的終止子為NOS。

4.如權利要求3所述的在植物營養組織中異位表達的載體，其特征在于：所述載體是以pBI121雙元載體為骨架構建的。

5.如權利要求2所述的在植物營養組織中異位表達的載體，其特征在于：構建所述載體的方法，包括以下步驟：

a、選擇pBI121雙元載體為構建骨架；在35S的5’端引入包括BamHI，XmaI，SmaI，XhoI和SacI的多克隆位點后將其插入pBI121中獲得pBI121-35S；

b、擴增35S-NOS DNA片段；然后在35S-NOS DNA片段的5’端加入KpnI-ClaI-StuI多酶切位點，3’端加入HindIII-ClaI-EcoRI多酶切位點，再通過KpnI和EcoRI將35S-NOS DNA片段克隆到載體pYES2中，獲得中間載體pYES2-35S-NOS；

c、以擬南芥基因組DNA為模板，擴增含有At4g25710 基因的3’UTR和At4g25700 基因的啟動子（BCH1）及5’UTR的DNA片段，再在該DNA片段的5’端加入BamHI酶切位點，3’端加入SacI酶切位點，然后通過BamHI和SacI將該DNA片段插入到載體pYES2-35S-NOS中，獲得中間載體pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS；

d、以擬南芥的cDNA為模板，擴增OLEO2目的基因，然后在OLEO2目的基因的5’末端和3’末端均加上SacI單酶切位點，再通過單酶切位點SacI將OLEO2目的基因克隆到載體pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS，獲得中間載體pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR- OLEO2-NOS；

e、以擬南芥的cDNA為模板，擴增DGAT1目的基因，然后在DGAT1目的基因的5’末端和3’末端均加上BamHI單酶切位點，再通過單酶切位點BamHI將DGAT1目的基因克隆到載體pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS，獲得中間載體pYES2-35S-3’UTR-DGAT1-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS，即pYES2-DGAT1-OLEO2；

f、以酵母基因組為模板，擴增GAT1目的基因，在GAT1目的基因的5’端引入酶切位點BamHI，3’端引入酶切位點XhoI，通過BamHI和XhoI將GAT1目的基因克隆到載體pBI121-35S，構成單基因表達載體pBI121-35S-GAT1；然后將中間載體pYES2-DGAT1-OLEO2中的基因片段DGAT1-OLEO2通過ClaI位點克隆到載體pBI121-35S-GAT1，獲得三基因植物表達載體pBI121-DGAT1-OLEO2-GAT1；

g、以擬南芥的cDNA為模板，擴增LEC2目的基因，再在其3’端引入XbaI、5’端引入SacI，然后將LEC2目的基因克隆到pBI121-35S，構成單基因表達載體pBI121-LEC2；在擴增的LEC2目的基因的5’末端和3’末端均加上StuI單酶切位點，再通過單酶切位點StuI將LEC2目的基因克隆到三基因植物表達載體pBI121-DGAT1-OLEO2-GAT1，獲得四基因表達載體pBI121-LEC2-DGAT1-OLEO2-GAT1。