[發(fā)明專利]一種針對(duì)乳腺癌的Car?NK細(xì)胞制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710728653.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-23
• 公開（公告）號(hào): CN107267463A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張正亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽惠恩生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/0783
• 代理公司: 北京力量專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11504
• 代理人: 毛雨田

1.一種針對(duì)乳腺癌的Car-NK細(xì)胞制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

S1、采集患者外周富集血，濾除白細(xì)胞后緩慢移入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，用密度梯度離心法離心，吸取白膜層，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；

S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2-2.5x10⁶；

S3、取S2中的重懸液90mL加入已滅活的自體血清10mL和IL-210ng/mL,接種至六孔培養(yǎng)板中，六孔培養(yǎng)板中加入有0.9％氯化鈉注射液和Lymactin-NK；

S4、培養(yǎng)36-48h后于培養(yǎng)板中加入終濃度為800-1200IU/ml IL-2、100-200IU/ml IL-15和10-20IU/ml IL-21，培養(yǎng)6-8d后補(bǔ)加滅活自體血漿、IL-2、IL-15和IL-21，繼續(xù)培養(yǎng)2-3d得到NK細(xì)胞；

S5、將慢病毒對(duì)S4中的NK細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR-NK細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)乳腺癌的Car-NK細(xì)胞制備方法，其特征在于：所述密度梯度離心法離心參數(shù)為2000-2200r/min，20-25℃，15-20min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)乳腺癌的Car-NK細(xì)胞制備方法，其特征在于：所述氯化鈉注射液和Lymactin-NK的體積比為4：1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)乳腺癌的Car-NK細(xì)胞制備方法，其特征在于：所述S3中六孔培養(yǎng)板中每孔液體終體積為3mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)乳腺癌的Car-NK細(xì)胞制備方法，其特征在于：所述S4中培養(yǎng)6-8d后補(bǔ)加滅活自體血漿、IL-2、IL-15和IL-21的終濃度分別為10％、1000IU/ml、100IU/ml和50IU/ml。