[發明專利]一種磁性納米材料介導的CRISPR/Cas9 T細胞內遞送系統及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710728571.0
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107557393B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 樊春海;諸穎;王麗華;夏凱;任寧;孔華庭
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海應用物理研究所
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/90
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪;余永莉

1.一種磁性納米材料介導的CRISPR/Cas9 T細胞內遞送系統的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）采用陽離子聚合物對一定大小的磁性納米顆粒團簇進行修飾獲得一種納米載體，所述磁性納米顆粒團簇的粒徑為50~200 nm，所述磁性納米顆粒選自：Fe₃O₄納米顆粒，γ-Fe₂O₃納米顆粒或CoFe₂O₄納米顆粒；

2）提供靶向目標基因的CRISPR/Cas9系統表達質粒，所述的靶向目標基因的CRISPR/Cas9系統包括表達Cas9蛋白和/或sgRNA的質粒，其中，表達Cas9蛋白的質粒有pMJ920和pCAG-T3-hCAS-pA，表達sgRNA的質粒有SP6-sgRNA-scaffold，Cas9蛋白和sgRNA共表達質粒有pX330、pX458或pX459；

3）將步驟1）所得納米載體與所述靶向目標基因的CRISPR/Cas9系統表達質粒共孵育獲得一種納米復合物；以及

4）在磁場作用下，將步驟3）所得納米復合物與T細胞共孵育，制得一種磁性納米材料介導的CRISPR/Cas9 T細胞內遞送系統，其中，所述的T細胞包括：CD4⁺T 細胞、CD8⁺T細胞、NKT細胞的原代T細胞，或Jurkat T細胞株。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4）中的磁場包括均勻磁場和非均勻磁場。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1）中所述的陽離子聚合物選自：聚丙烯氯化銨、L-多聚賴氨酸、D-多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、陽離子聚丙烯酰胺、聚乙二醇或殼聚糖中的一種。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述納米載體與所述靶向目標基因的CRISPR/Cas9系統表達質粒孵育的質量比例為：10:1~30:1，孵育的時間為：10~30 min，孵育的溫度為25~37°C。

5.一種根據權利要求1-4中任意一項所述的制備方法制得的磁性納米材料介導的CRISPR/Cas9 T細胞內遞送系統。

6.一種根據權利要求5所述的磁性納米材料介導的CRISPR/Cas9 T細胞內遞送系統在非治療目的的T細胞目的基因編輯中的應用。