[發(fā)明專利]一種四環(huán)素的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710726769.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-24
• 公開（公告）號(hào): CN107290526A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹晶;劉麗青;胡雪婷;常燕;杜愛銘;徐兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 太原瑞盛生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體是一種四環(huán)素的免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

四環(huán)素是四并苯或萘并苯的衍生物，是一種光譜抗菌藥。它是由鏈霉菌培養(yǎng)液中提取或經(jīng)半合成而得的抗生素，因其分子中含有4個(gè)環(huán)而得名。在水產(chǎn)、牛奶、雞蛋、蜂王漿等中加入四環(huán)素，可用于抑制多種細(xì)菌及立克次氏體、衣原體、支原體等所引起的感染。但是四環(huán)素類藥物主要通過腎小球?yàn)V出，這類藥物中含有許多羥基、烯醇羥基及羰基，在中性條件下能與多種金屬離子形成不溶性螯合物。如與鈣或鎂離子形成不溶性的鈣鹽或鎂鹽、與鐵離子形成紅色絡(luò)合物。在體內(nèi)四環(huán)素會(huì)與鈣離子形成黃色絡(luò)合物而沉積在骨骼和牙齒上，小兒服用會(huì)發(fā)生牙齒變黃，孕婦服用后其產(chǎn)兒可能發(fā)生牙齒變色，進(jìn)而影響牙齒和骨骼的發(fā)育。此外，這類藥物還會(huì)引起肝損害，會(huì)使腸道菌群失調(diào)、易誘導(dǎo)耐藥菌株。因而食品中四環(huán)素殘留會(huì)對(duì)人們的身體健康帶來極大的隱患。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局在2008年對(duì)牛奶和奶粉中四環(huán)素的殘留量做出規(guī)定，2009年對(duì)蜂蜜中四環(huán)素的殘留量做出規(guī)定，因此我們對(duì)食品中殘留的四環(huán)素的檢測具有非常重要的意義。

目前四環(huán)素的檢測方法有: 微生物法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、膠體金法、化學(xué)發(fā)光法。微生物法特異性差，操作繁瑣，檢測周期較長且結(jié)果誤差較大。CN 1707265 A（2005年12月）公開了一種酶聯(lián)免疫法檢測四環(huán)素的試劑盒,采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測的缺點(diǎn)是辣根過氧化酶或堿性磷酸標(biāo)記物易失活，顯色底物見光易分解，靈敏度低，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物具有一定的交叉反應(yīng)，造成測試結(jié)果不準(zhǔn)確，并且只適用于微量物質(zhì)的檢測和鑒定。CN 102401818 A（2012年4月）公開了一種高效液相色譜法檢測四環(huán)素的方法,采用高效液相色譜法的缺點(diǎn)為樣品前處理復(fù)雜，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，檢測成本高。CN 103105490 A（2011年11月）公開了一種膠體金檢測四環(huán)素的試劑盒,采用膠體金法進(jìn)行檢測的缺點(diǎn)是最后檢測結(jié)果是以肉眼可見的顏色進(jìn)行表征，誤差較大，并且操作繁瑣，流程較多，更易出現(xiàn)誤差，靈敏度低。本發(fā)明采用方法為直接化學(xué)發(fā)光法，采用吖啶酯作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)是：①背景發(fā)光低，信噪比高，發(fā)光反應(yīng)干擾因素少；②閃光型發(fā)光，光釋放快速集中、發(fā)光效率高、發(fā)光強(qiáng)度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗體結(jié)合位點(diǎn)，提高系統(tǒng)整體靈敏度；④易于與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少；⑤標(biāo)記物穩(wěn)定，不受環(huán)境氧化劑的影響，在2-8℃下可保存數(shù)月之久。因此吖啶取代物是一類非常有效的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

本發(fā)明采用的方法為化學(xué)發(fā)光法，其優(yōu)點(diǎn)為：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確快速、檢測時(shí)間短、線性范圍寬，檢測結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種具有較高靈敏度和特異性的檢測食品中四環(huán)素的試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種四環(huán)素的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法，本發(fā)明所提供的化學(xué)發(fā)光法檢測四環(huán)素的試劑盒，可以采取四環(huán)素抗體偶聯(lián)磁微粒，吖啶酯標(biāo)記四環(huán)素，也可以采取四環(huán)素抗原偶聯(lián)磁微粒，吖啶酯標(biāo)記四環(huán)素抗體。試劑盒還包括四環(huán)素校準(zhǔn)品、化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液A、化學(xué)發(fā)光激發(fā)液B以及清洗液。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為吖啶酯，如：NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述的吖啶酯標(biāo)記的是四環(huán)素抗原或四環(huán)素抗體。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述的吖啶酯標(biāo)記四環(huán)素抗原或抗體的標(biāo)記緩沖液為pH 8.0-11.0、濃度為0.1mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃，優(yōu)選pH為10.0。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述的吖啶酯與抗原或抗體的摩爾比為5-100:1，優(yōu)選摩爾比為7.4:1。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述的吖啶酯溶于DMSO或DMF中，且所配制溶液的最終濃度為0.1-100 mmol/L，優(yōu)選濃度為6.5 mmol/L。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述的磁微粒可直接與四環(huán)素抗體或抗原偶聯(lián)，也可將磁微粒與鏈霉親和素偶聯(lián)，同時(shí)采用生物素標(biāo)記四環(huán)素抗體或抗原。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，所述磁珠的表面修飾基團(tuán)為羧基、氨基、鏈霉親和素-生物素或?qū)妆交酋；４胖槭褂们肮滔嗟牟煌耆两禃?huì)影響精確度，因此選擇時(shí)應(yīng)選分散性好，長時(shí)間放置磁珠抱團(tuán)個(gè)數(shù)少，沉降速度慢的磁珠。