[發明專利]一種兜蘭花粉低溫干燥保存方法

在審

• 申請號: 201710725118.4
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107466593A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 鄭楓;曾宋君;吳艷妮;吳坤林
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: A01D46/00
• 分類號: A01D46/00;A01H1/02;A01N3/00;F26B5/16
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于植物繁殖技術領域，具體涉及一種兜蘭花粉低溫干燥保存方法。

背景技術：

兜蘭(Paphiopedilum)又叫拖鞋蘭、仙履蘭等，全世界有90多個種，主要分布于亞洲熱帶地區至太平洋島嶼。兜蘭由于其獨特的花朵造型、絢麗的花朵色彩、持久的觀賞花期而具有極高的觀賞價值，是國際花卉市場上十分流行的高檔花卉，在世界上具有大量的愛好者。但由于人們對兜蘭的過度追逐而對野生資源進行了毀滅性的采挖，兜蘭已成為世界上最瀕危的植物物種之一，所有野生種類均被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄I而被禁止貿易。

兜蘭雜交種比原生種姿態更為優美，生長勢和抗逆性強，在花色上比原生種更為豐富多彩，也能在國際市場上進行交易，現已成為世界兜蘭產業的主流產品。我國兜蘭的雜交育種工作還剛剛起步，盡管我國具有豐富的兜蘭資源(約有30多種)，然而許多兜蘭種類及雜交種的花期不一致，它們之間不能利用新鮮花粉進行雜交育種。利用花粉的低溫干燥保存技術能有效地解決這個問題，培育出大量的兜蘭雜交種。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種保存時間長、花粉活力高的兜蘭花粉低溫干燥保存方法。

本發明的兜蘭花粉低溫干燥保存方法，包括以下步驟：在兜蘭花朵完全展開的3-5天內，應用滅菌的挑取工具將其藥帽打開，接著用該滅菌的挑取工具將兜蘭花粉塊挑至潔凈無菌的容器中，在無菌狀態下對花粉塊進行脫水，然后將脫水后的花粉塊密封好，置于4℃條件下避光保存。

具體步驟如下：在兜蘭花朵完全展開的3-5天內，于上午10-12時應用滅菌的牙簽輕輕將其藥帽打開，接著用滅菌的牙簽粘上兜蘭花粉塊并將其迅速放至潔凈無菌的塑料離心管內，每管放入1個花粉塊，立即將離心管蓋上并密封好，然后將放置了花粉塊的塑料離心管用一無菌的玻璃瓶集中裝起來并密封好，在無菌狀態下，將貯存花粉的塑料離心管的蓋打開，管口蓋上無菌的脫脂棉后放入具有硅膠粒干燥劑的玻璃瓶中脫水48-96小時，然后蓋上塑料離心管蓋再放置于4℃條件下避光保存。

所述的兜蘭優選為海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae)或彩云兜蘭(Paphiopedilum wardii)。

利用本發明的方法保存兜蘭花粉塊，保存的時間可達6～12個月，經回暖回濕處理后，采用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法測定花粉活力發現，該保存方法保存的花粉活力強，自交或雜交成功率高達90％～95％。本發明的方法解決了不同花期的兜蘭品種和植株的雜交授粉阻礙，為我國兜蘭新品種培育及其產業的進一步發展奠定基礎，因此具有重大的社會效益和經濟效益。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。

實施例1：海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae)保存花粉的自交授粉

(1)花粉的采集和保存

10月份，在海倫兜蘭花朵完全展開3天時，于上午10時應用高溫高壓滅菌的牙簽小心將其藥帽打開，接著用滅菌的牙簽粘上開花后花粉塊并將其迅速放至潔凈無菌的1mL塑料離心管內，每管放入1個花粉塊，并立即將離心管管蓋上和密封好。每取1個花粉塊更換一個新的牙簽。然后將放置了花粉塊的離心管用一無菌的玻璃瓶集中裝起來并密封好帶回實驗室。然后在無菌狀態下，將貯存花粉的塑料離心管的蓋打開，管口蓋上無菌的脫脂棉后放入具有硅膠粒干燥劑的玻璃瓶中脫水48小時，然后蓋上離心管蓋再放置于4℃條件下避光保存。

(2)磷酸緩沖液和TTC溶液的配制

磷酸緩沖液(66m mol/L，pH 7.0)的配制：A液稱取Na₂HPO₄·2H₂O 1.188g溶于蒸餾水中，定容至100mL；B液稱取KH₂PO₄ 0.908g溶于蒸餾水中，定容至100mL；用時取A液60mL、B液40mL混合即可。

TTC溶液(0.5％)的配制：稱取0.05g TTC溶于磷酸緩沖液(66m mol/L，pH 7.0)，并用磷酸緩沖液(66m mol/L，pH 7.0)定容至10mL，置于冰箱閉光冷藏備用。

(3)低溫干燥保存花粉的活力測定

第2年10月份，將4℃低溫干燥保存12個月的裝載花粉的離心管取出，在25℃室溫下，在裝載花粉的離心管加入3滴無菌水回暖回濕處理90分鐘，然后干癟的花粉塊基本能恢復到原來的大小和顏色。