[發明專利]一種檢測肺表面活性蛋白A的核酸適配體液晶生物傳感器及其制備和檢測方法

在審

• 申請號: 201710710824.1
• 申請日: 2017-08-18
• 公開（公告）號: CN107505469A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 王穎;王兵;李業芹;鄧世雄;熊興良
• 申請（專利權）人: 濟寧醫學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/23
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司11530
• 代理人: 趙永強

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，具體涉及一種檢測肺表面活性蛋白A的核酸適配體液晶生物傳感器，以及該液晶生物傳感器的制備方法與檢測方法。

背景技術

肺表面蛋白A(Pulmonary Surfactant Protein A，SP-A)， 是一種多功能糖蛋白，它在調節肺表面活性物質(PS)代謝、基因表達、肺部免疫和炎癥反應中起著重要的作用。SP-A主要形成于Ⅱ型肺泡上皮細胞，肺外少量表達，在肺內的高表達。肺表面活性蛋白A的高或低表達水平和一些臨床肺部疾病直接相關，與此同時它也是一些特定的肺部疾病診斷和預后的指標。許多肺部疾病在早期很難根據早期臨床表現，X射線檢查和一些創傷性跡象檢查來評估肺泡毛細血管屏障的損傷程度。最近，許多實驗表明， SP-A血清水平的敏感和可靠指標能夠反映肺功能障礙和血氣屏障的損害。疾病導致肺損傷時，SP-A通過破壞的肺泡毛細血管膜屏障進入血液循環，成為肺損傷的血清標志物。血清SP-A與肺損傷的程度密切相關。SP-A在血清的濃度越高，肺損傷程度越重。血液循環SP-A水平的檢測可以判斷患者肺損傷程度, 預測疾病的結果。目前， SP-A主要的檢測方法是放射免疫分析（RIA）測定的方法， 酶聯免疫吸附(ELISA)， 化學發光法和單個或多個斑點免疫印跡方法，這些方法存在制備周期過長，抗體高成本，容易失活等缺點。

液晶（Liquid crystal ,LC）兼有液體的流動性及固體的光、電、磁等各向異性等特點。處于向列型液晶態的液晶分子具有長程取向序而無位置序，這一獨特的分子排列方式導致表面微小的地貌或化學結構變化即可引起取向變化，同時此取向變化能傳播至數十微米的液晶體中，因此液晶具有很強的光學信號放大作用。液晶生物傳感器的檢測原理是建立在液晶具有雙折射特性基礎上，根據傳感界面接觸目標物前后，液晶分子在基底表面的取向排列發生變化，改變對光線的折射能力，導致光學圖像信號的顏色和亮度發生變化，實現對目標分子的檢測。由于液晶傳感器具有響應快、無需標記、無需復雜和昂貴的讀取裝置和可肉眼直接檢測等優點，同時利用核酸適配體的液晶傳感器用于肺表面活性蛋白A的檢測尚鮮見報道。

核酸適配體（Aptamer）是通過指數富集的配體系統進化技術（SELEX）篩選得到的一段單鏈DNA或RNA分子，可以特異性結合目標分子。由于具有選擇性高、易合成、易修飾和相對穩定的優點，目前在檢測蛋白質、金屬離子、有機小分子等領域中應用廣泛。本發明首次將基于核酸適配體的液晶生物傳感器用于檢測肺表面活性蛋白A。與此同時,我們也建立一個新型敏感的核酸適配體液晶生物分子分析的平臺。

發明內容

本發明的第一目的是針對現有技術的不足，提供一種用于檢測肺表面活性蛋白A的核酸適配體液晶生物傳感器，其特征在于所述的液晶生物傳感器含有肺表面活性蛋白A核酸適配體。該液晶生物傳感器含有肺表面活性蛋白A核酸適配體，該液晶生物傳感器具有低成本、操作簡單、可肉眼觀測、靈敏度高等優點，可以快速的結合目標分子，達到快速準確檢測SP-A的目的。

一種檢測肺表面活性蛋白A的核酸適配體液晶生物傳感器，其特征在于所述肺表面活性蛋白A核酸適配體的序列為5'-NH₂-(CH₂)₆-TGTACGCCTACTGTGTGT-3' ，且在5'端修飾了氨基。

本發明的第二目的是提供一種核酸適配體液晶傳感器的制備方法和檢測方法。

本發明所述的檢測肺表面活性蛋白A的核酸適配體液晶生物傳感器的制備方法和檢測方法，包括以下步驟：

步驟一：玻片的清洗與處理

玻片處理用以去除玻璃表面的灰塵和有機物，同時使表面羥基化,將載玻片切割成尺寸為2 cm×2 cm后放入大燒杯中，往燒杯中倒入濃H₂SO₄，再倒入雙氧水溶液，其中濃H₂SO₄和雙氧水體積比為7:3，將燒杯置于80 ℃水浴鍋中溫育1小時，取出后用無水乙醇和去離子水依次清洗5至6次，氮氣吹干置于110 ℃烘箱中干燥2-3小時，防塵保存；

步驟二：傳感器基底的組裝：

上玻片：上玻片用N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基硅烷(簡稱DMOAP)水溶液組裝

將處理的玻片浸入含體積比為0.35% DMOAP的水溶液中，常溫下靜置反應30min，用大量超純水沖洗，氮氣吹干，于110℃烘箱干燥1小時。