[發明專利]一種煙草腋芽生長調控基因NtMOC1及其克隆方法與應用

有效

• 申請號: 201710708197.8
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN107267528B
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 李梅云;宋中邦;王丙武;高玉龍;李文正;李永平;師君麗;李峰;孔光輝;徐向麗;鄒聰明;鄭昀曄
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 53116 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業)
• 代理人: 姜開俠;謝喬良

1.一種煙草腋芽生長調控基因NtMOC1，其特征在于所述煙草腋芽生長調控基因NtMOC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述煙草腋芽生長調控基因NtMOC1的克隆方法包括以下步驟：

A、確定NtMOC1基因序列；

根據GenBank 登錄號 XP_015642672.1的水稻MOC1基因蛋白序列，搜索NCBI數據庫得到煙草中同源基因NtMOC1序列，利用此序列設計基因克隆引物：

正向引物：5’-GGTACCATGTTAGGATCCTTTGGTTC-3’；

反向引物：5’-CTCGAGTTAACGCCAAGAAGATATGG-3’；

B、提取煙草根組織RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；

C、根據NtMOC1基因序列設計合成特異性引物，所述特異性引物為：正向引物：5’-GGTACCATGTTAGGATCCTTTGGTTC-3’，反向引物：5’-CTCGAGTTAACGCCAAGAAGATATGG-3’；以反轉錄得到的第一鏈cDNA作為模板，進行PCR擴增，選用Phusion高保真擴增酶反應體系，體系總體積50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應緩沖液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion^? High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，補水至50μL，PCR反應在Mastercycler^? pro擴增儀上進行，反應程序為：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35個循環；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產物；

D、純化產物與載體連接，通過試劑盒反應與TOPO載體連接，連接體系與過程如下：4μL純化產物、1μL salt solution、1μL PCR^?-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min；將連接好的載體通過熱激轉化大腸桿菌DH5a，加液體培養基振蕩培養后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上過夜培養，挑取菌落進行菌液培養，質粒提取和PCR檢測，篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序。

2.根據權利要求1所述的煙草腋芽生長調控基因NtMOC1，其特征在于D步驟中所述培養基配方及制備方法是稱取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸餾水中，121℃滅菌25min得到。

3.一種權利要求1所述煙草腋芽生長調控基因NtMOC1的應用，其特征在于所述煙草腋芽生長調控基因NtMOC1在用于獲得打頂后煙草產生腋芽的長度和重量顯著降低的轉基因植株中的應用。