[發明專利]一種利用兩步重疊PCR法獲取人體組織中MYC基因的方法

有效

• 申請號: 201710708098.X
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN107446918B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 華子昂;馬慧;萬君興;周翔;馬虎;張明賀;張薇
• 申請（專利權）人: 華子昂
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 銀川長征知識產權代理事務所 64102
• 代理人: 馬長增

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用兩步重疊PCR法獲取人體組織中MYC基因的方法。該方法，包括：(1)TES水浴脫蠟；(2)提取人體組織樣本的DNA；(3)查找并選擇7條長度相同的MYC基因序列；(4)設計16條MYC基因的特異性引物；(5)兩步重疊PCR擴增；(6)純化DNA片段；(7)測定DNA濃度；(8)基因檢測。利用本發明，準確度高、效率高，脫蠟效果更好，對環境與人體的損傷更小，操作簡單、成本低廉，擴增出5279bp不同序列的MYC目的基因的DNA片段，目的基因的純度及濃度較高，通過測序法驗證了目的基因的片段，為生物醫學的研究提供便利。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用兩步重疊PCR法獲取人體組織中MYC基因的方法。

背景技術

福爾馬林固定石蠟包埋技術是臨床病理診斷中使用最廣泛的。在福爾馬林固定石蠟包埋技術中，福爾馬林作為固定劑，能夠減小組織形態在一定時間內的變化，為后續的免疫組化、組織學分析及基因診斷等方面提供可靠的保障。

現有的福爾馬林固定石蠟包埋技術仍存在如下缺陷：首先，標本中提取出的DNA濃度較低、片段較短，隨著時間的推移，標本的質量逐漸降低，使得獲取完整的基因變得相當困難，而DNA的片段化會導致目的基因缺失完整性，使得檢測結果不可靠、數據拼接更困難，從而無法分析MYC全長基因的單倍型信息，給臨床檢驗與醫學科學研究造成很大的障礙；其次，現有的石蠟包埋組織脫蠟方法中常采用二甲苯脫蠟法，但是二甲苯易污染環境、對人體有害，而且抽提過程較長；再次，目前獲取目的DNA片段的方法有PCR、酶切、基因芯片、雜交捕獲等，但是獲得的片段存在容易斷裂、純度與濃度較低、雜質較多、長度較短等問題，同時，普遍用于福爾馬林固定石蠟包埋人體組織DNA檢測的二代測序法也存在著讀長較短、測序深度太大以及對高GC區域、重復區域和堿基修飾區域不敏感等問題，使得信息拼接量較大，無法將MYC基因測通，從而增加了長片段DNA結果分析的難度。因此，急需建立一種從福爾馬林固定石蠟包埋人體組織中獲取高質量、高濃度及完整性較強的長片段目的基因的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種獲取人體組織中MYC基因的方法，利用TES水浴脫蠟及兩步重疊PCR法，從福爾馬林固定石蠟包埋人體組織中獲取長片段DNA，即MYC基因，并利用Sanger測序進行驗證。

本發明解決上述技術問題的技術方案為：

一種利用兩步重疊PCR法獲取人體組織中MYC基因的方法，包括如下步驟：

(1)取福爾馬林固定石蠟包埋人體組織樣本，按照8μm～12μm的厚度切片，再進行TES水浴脫蠟操作，其中，TES水浴脫蠟操作的過程為：加入800μL～1200μL的TES(三羥甲基甲胺基乙磺酸)溶液，充分震蕩后，在50℃～60℃下孵育25min～35min，再次充分震蕩并混合均勻，再在4℃下、轉速為8000rpm～14000rpm的離心機下離心10min～15min，棄去上清液，并重復TES水浴脫蠟操作2～3次；

(2)提取經過脫蠟后的人體組織樣本的DNA；

(3)查找并選擇7條長度相同的MYC基因序列；

(4)根據步驟(3)查找到的MYC基因序列，設計16條MYC基因的特異性引物，其序列號如下：

第1條：F1-AGAAGGGCAGGGCTTCTCA、R1-ATCTAACTCGCTGTAGTA；

第2條：F2-AAAGAACGGAGGGAGGGAT、R2-TATGGGCAAAGTTTCGTGG；

第3條：F3-CGAAACTTTGCCCATAGC、R3-TGGACTTCGGTGCTTACCTG；

第4條：F4-GGTAAGCACCGAAGTCCAC、R4-AAAGCAGGAATGTCCGAC；