[發明專利]一種制備家鴿腸壁肌間神經叢內NOS神經元樣品的方法

有效

• 申請號: 201710707968.1
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN107418935B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 孫海基;馬曉麗;趙盼;王天霞
• 申請（專利權）人: 山東師范大學;濟南市中心醫院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發明涉及一種制備家鴿腸壁肌間神經叢內NOS神經元樣品的方法，步驟如下：(1)制備待觀察腸道；(2)取待觀察腸道，制備固定后樣品；(3)將固定后樣品截段后，剝離肌層，然后剝離神經叢上的縱形肌，置于磷酸緩沖液中保存，制得待染樣品；(4)將待染樣品經磷酸緩沖液沖洗后，浸入封閉液室溫封閉，然后浸入一抗溶液中，室溫孵育，制得一抗樣品；(5)將一抗樣品浸入山羊抗兔IgG的溶液中，搖床孵育，避光顯色，然后經脫水、封片，即得。本發明首次采用腸壁全層鋪片?NOS免疫組化技術制備家鴿腸壁肌間神經叢內NOS神經元樣品，制備過程中通過在制備樣品前注射肌松藥、剝離縱形肌，較為容易的實現了環形肌與縱形肌的分離。

技術領域

本發明涉及一種制備家鴿腸壁肌間神經叢內NOS神經元樣品的方法，屬于生物技術技術領域。

背景技術

腸神經系統(enteric nervous system,ENS)由腸壁肌間神經叢，粘膜下神經叢等組成，參與調節胃腸道的運動和分泌等功能。胃腸道蠕動主要源于并依靠平滑肌收縮，而平滑肌的興奮主要由乙酰膽堿等興奮性遞質介導，抑制主要由一氧化氮(NO)等抑制性遞質介導。1990年Bult首次提出了胃腸道氮能神經元興奮時釋放NO。一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase，NOS)在體內能催化L-精氨酸生成NO，是NO生成的標志酶。以往多用NADPH-黃遞酶組化法研究哺乳動物的NOS陽性神經元，但其特異性較差,并受實驗條件的影響。NOS抗體為一氧化氮合酶的特異性抗體，能較好顯示NOS陽性神經元的定位，已應用于哺乳動物神經系統NOS神經元的研究。

消化道全層鋪片技術是研究胃腸道神經系統的結構和功能基礎方法，能夠立體直觀地顯示腸道神經元在黏膜下層和肌間層的分布模式，利用消化道全層鋪片技術研究腸道神經系統的法已被廣泛接受和應用。但以往的研究主要集中在哺乳動物，僅有少部分文獻研究雞腸神經系統的超微結構。家鴿作為鳥類的典型代表，其腸道NOS神經元的形態及特征，不同腸段分布特點，還未見研究。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種制備家鴿腸壁肌間神經叢內NOS神經元樣品的方法。

本發明技術方案如下：

一種制備家鴿腸壁肌間神經叢內NOS神經元樣品的方法，步驟如下：

(1)按0.04～0.06mg/kg向家鴿注射肌松藥，5～30min后處死家鴿，取家鴿腸道，清理腸道內容物，制得待觀察腸道；

(2)取步驟(1)制得的待觀察腸道，結扎小腸的一端，用含有多聚甲醛質量百分比濃度為3.6～4.4％的磷酸緩沖液灌注后，結扎小腸的另一端，在4℃條件下，置于含有多聚甲醛質量百分比濃度為3.6～4.4％的磷酸緩沖液中固定6～8h，轉至含200～350g/L蔗糖的磷酸緩沖溶液中，4℃條件下脫水過夜，制得固定后樣品；

(3)將步驟(2)制得的固定后樣品截段后，剝離肌層，將肌層漿膜面向下平鋪于載玻片上，然后剝離神經叢上的縱形肌，保留環形肌層，置于磷酸緩沖液中保存，制得待染樣品；

(4)將步驟(3)制得的待染樣品經磷酸緩沖液沖洗后，室溫置于質量濃度為2.5～3.5％的H₂O₂中25～35min，然后經磷酸緩沖液沖洗后，浸入封閉液室溫封閉0.8～1.2h，然后浸入含有質量百分比濃度為0.2～0.5％的一抗溶液中，4℃過夜，然后室溫孵育0.8～1.2h，PBST沖洗，制得一抗樣品；

所述一抗為兔抗NOS抗體；購買于博士德生物公司；

所述封閉液為每百毫升PBST溶液含有5毫升山羊血清的溶液；

(5)將步驟(4)制得的一抗樣品浸入含有質量百分比濃度為0.1％的山羊抗兔IgG的溶液中，搖床孵育1.5～2.5h，分別用PBST溶液和PBS溶液沖洗，經DAB溶液避光顯色8～12min，PBS沖洗，然后經脫水、封片，即得。