[發明專利]一種生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法

有效

• 申請號: 201710707917.9
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN107674864B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 孫際賓;劉嬌;鄭平;王興初;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N1/21;C12N15/70;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 陳詳;崔佳佳

本發明公開了一種脯氨酸4?羥化酶及其應用。具體地，本發明提供了一種多肽在生產反式?4?羥基?L?脯氨酸或以反式?4?羥基?L?脯氨酸為前體的下游產物中的用途，所述多肽是：(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，并且具有催化L?脯氨酸生成反式?4?羥基?L?脯氨酸的功能；或(b1)從SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。本發明還提供了表達所述多肽的反式?4?羥基?L?脯氨酸生產菌株及其構建方法，以及生產反式?4?羥基?L?脯氨酸的方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體地說，本發明涉及具有脯氨酸4-羥化酶活性的蛋白、編碼該蛋白的基因和包含該酶或其編碼基因的基因工程菌以及它們在生產反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應用。

背景技術

反式-4-羥基-L-脯氨酸(簡稱羥脯氨酸),是一種具有獨特生理活性的氨基酸,易溶于水，廣泛應用于醫藥、化工、動物飼料和美容業等領域，市場前景廣闊，由于價格昂貴羥脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯類抗生素(美羅培南等)的側鏈。碳青霉烯類是第三代抗生素，是抗菌譜最廣的一類非典型β-內酰胺類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點，全球總體市場已超過了30億美元。

反式-4-羥基-L-脯氨酸可以通過脯氨酸4-羥化酶催化L-脯氨酸羥基化來生產，目前用于生產L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(E.coli)等，但是這些菌都沒有編碼脯氨酸4-羥化酶的基因。因此，挖掘能夠在L-脯氨酸生產菌中表達并具有高效催化活性的脯氨酸4-羥化酶是實現反式-4-羥基-L-脯氨酸工業生產的關鍵。

日本協和發酵公司通過篩選得到一株脯氨酸4-羥化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名為指孢囊菌RH1，測序獲得脯氨酸4-羥化酶基因序列(CN96190335)；該脯氨酸4-羥化酶在大腸桿菌中異源表達主要形成包涵體，進行密碼子優化后置于一個強啟動子的調控下，導入到大腸桿菌中，添加外源L-脯氨酸，在發酵罐中轉化100h后，反式-4-羥基-L-脯氨酸的積累量達到41g/L，轉化效率只有87％(Shibasaki,Takeshi,Hideo Mori,and Akio Ozaki.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecifichydroxylation of L-proline.Bioscience,biotechnology,and biochemistry 64.4(2000):746-750)。為了進一步降低反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產成本，日本協和發酵公司又將密碼子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羥化酶基因導入到L-脯氨酸生產菌中，在以葡萄糖為底物的發酵培養基中培養99h后反式-4-羥基-L-脯氨酸產量達到25g/L，發酵溫度為33℃，發酵過程L-脯氨酸最高積累量達到7.8g/L，初步實現了反式-4-羥基-L-脯氨酸的從頭合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi,et al.Construction of a novelhydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene.Journal of bioscience and bioengineering 90.5(2000):522-525.)，該文獻水平為目前報道的最高水平。

然而，目前報道的具有工業應用前景的脯氨酸4-羥化酶只有來源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羥化酶。指孢囊菌屬于放線菌，是一種高GC含量的革蘭氏陽性細菌，指孢囊菌RH1脯氨酸4-羥化酶基因的GC含量為74％，并且含有大腸桿菌的稀有密碼子。因此，指孢囊菌的野生型脯氨酸4-羥化酶在原核生物，例如大腸桿菌中重組表達時主要以沒有活性或活性很低的包涵體形式存在，經過密碼子優化后的突變型脯氨酸4-羥化酶在表達量和催化性能上依然較差。