[發明專利]一種基于G-四聯體核酸適配體熒光探針檢測牛奶中環丙氨嗪的方法

有效

• 申請號: 201710705105.0
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN107505298B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 邢海波;胡曉鈞;周世英;田富箱
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

本發明公開了一種基于G?四聯體核酸適配體熒光探針檢測牛奶中環丙氨嗪的方法。當檢測體系中沒有環丙氨嗪時，修飾在適配體上的熒光素FAM會在520nm處釋放出熒光；當體系中加入環丙氨嗪后，環丙氨嗪和功能核酸上的胸腺嘧啶結合，促進功能核酸形成G?四聯體結構，抑制了520nm處的熒光釋放，基于釋放出的熒光信號與環丙氨嗪濃度呈反比，通過測定熒光信號可實現牛奶中環丙氨嗪的定量檢測。本方法可用于牛奶中環丙氨嗪的檢測，檢測靈敏度高，最低檢測限0.68ppb，選擇性好，操作簡便，前處理簡單，不需要大型儀器。

技術領域

本發明屬于環丙氨嗪檢測技術領域，特別涉及一種基于G-四聯體核酸適配體熒光探針檢測牛奶中環丙氨嗪的方法。

背景技術

環丙氨嗪(Cyromazine，Cyr)的化學名為2-環丙胺基-4，6-二氨基三嗪，與阿特拉津、西瑪津、莠滅津、撲滅津等同屬三嗪類或均三氮苯化合物，是一種高效抑制昆蟲生長劑、殺寄生蟲類殺蟲劑，在畜禽養殖過程中作為飼料添加劑使用。研究表明環丙氨嗪進入動物體內絕大部分以原藥或代謝物形式通過奶或者糞尿排泄，隨后再經由畜禽糞便暴露在土壤和水環境中。土壤或水環境中的環丙氨嗪通過環境轉歸再次進入食物鏈，對不同營養級生物和人體的健康造成潛在隱患。環丙氨嗪在動物和植物體內經脫烷基化作用代謝為三聚氰胺(Melamine，Mel)，而三聚氰胺的主要代謝產物為三聚氰酸(Cyanuric acid，CA)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide，Amd)和三聚氰酸二酰胺(Ammeline，Amn)。長期涉入三聚氰胺會導致膀胱結石，膀胱癌的發生率明顯提高。

對牛奶中環丙氨嗪及其代謝產物的快速檢測，可以有效避免有毒有害物質進入人體。環丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺是一組分子量小、且極性強的化合物，要想將環丙氨嗪及其相關代謝物從實際樣品中提取出來非常困難。美國EPA嚴格規定了環丙氨嗪必須作為飼料添加劑且只能放置在廄舍喂飼槽中使用，但仍有通噴灑用于飼養場所、堆肥、垃圾等處的滅蠅。環丙氨嗪經動物口服后絕大部分以原藥或代謝產物三聚氰胺形式經動物尿糞排泄，在動物體內殘留很少。美國EPA和PRC制定了環丙氨嗪在一系列動植物食品中的最高殘留標準，其中牛奶為0.05mg/kg。

根據環丙氨嗪及其代謝產物三聚氰胺在食品中的限量標準要求，目前常用于環丙氨嗪及其代謝產物殘留檢測的方法有容量分析法；色譜分析方法，包括高效液相色譜法；免疫化學分析法；光學分析法等。在GB 29704-2013中采用超高效液相色譜-串聯質譜法來測定動物性食品中環丙氨嗪的殘留。隨著環丙氨嗪類獸藥殘留檢測列入生乳收購及乳制品產品出廠必檢項目，而由于上述檢測方法和條件的限制，面對龐大的檢測數量會導致成本巨大且工作量重，難以滿足現場快速檢測的需求，這就在客觀上要求改進現有的檢測方法，開發出高通量、快速、高靈敏的環丙氨嗪檢測方法，用于日常監控。

核酸適配體是通過指數富集配體系統體外進化(SELEX)技術，從大量寡聚核苷酸庫中篩選出對靶物質具有高特異性和高結核性的核酸片段。但與蛋白質類抗體和生物酶相比，核酸適配體具有更高的親和力、穩定性和特異性，且易于標記設計出傳感器，已經用于核酸、蛋白、無機金屬離子及病毒顆粒和細胞的檢測。盡管胸腺嘧啶可以與環丙氨嗪的代謝產物三聚氰胺通過氫鍵結合已有報道，但可與環丙氨嗪特異性結合形成G-四聯體的適配體還未有篩選或合成出來，并且基于此使用熒光分光光度計用于檢測也未見報道。

發明內容

本發明的目的是利用不同濃度的環丙氨嗪可以不同程度的淬滅檢測液中熒光素的熒光強度的現象，提供一種靈敏度高、選擇性好、成本低的牛奶中環丙氨嗪的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明提供了一種利用熒光素FAM修飾的可形成G-四聯體的核酸適配體檢測液檢測牛奶中環丙氨嗪的方法。熒光素FAM修飾在核酸適配體的5’端，形成穩定檢測液，在激發光波長為480nm時，會在520nm處釋放出穩定的熒光。