[發(fā)明專利]用于顯微注射的蜜蜂卵移取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710703765.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-16
• 公開（公告）號(hào): CN107258703B
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇松坤;耿海洋;聶紅毅;張猛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K67/033
• 分類號(hào): A01K67/033
• 代理公司: 35100 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明涉及一種用于顯微注射的蜜蜂卵移取方法，首先利用蜂王產(chǎn)卵的生物學(xué)特性進(jìn)行限王產(chǎn)卵，然后利用蜂卵直立黏在巢房底部的特點(diǎn)以及蜂蠟的粘性，用移蟲針鏟出蜂卵底部的蜂蠟，將其粘在巢礎(chǔ)條上。本發(fā)明對(duì)大量取自1小時(shí)內(nèi)蜂卵進(jìn)行轉(zhuǎn)移，取得孵化率達(dá)94%的效果，解決了1小時(shí)內(nèi)蜂卵孵化率低的難題，提供了一種高效移取蜜蜂卵的方法。可以無傷害轉(zhuǎn)移大量1小時(shí)內(nèi)的蜂卵，為蜜蜂基因組編輯技術(shù)在蜜蜂育種領(lǐng)域中的應(yīng)用提供方法支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蜜蜂卵的移取方法，具體涉及一種用于顯微注射的蜜蜂卵移取方法，屬于蜜蜂育種技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，其產(chǎn)品及其制品在保健行業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域起著越來越重要的作用。同時(shí)蜜蜂又是植物重要的傳粉者，其授粉價(jià)值和生態(tài)作用更是不可估量。而作為重要的模式生物，在蜜蜂生物學(xué)基礎(chǔ)研究和基因功能研究等方面卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他模式生物。分析其原因可以發(fā)現(xiàn)，在蜜蜂領(lǐng)域內(nèi)缺少行之有效的基因編輯工具是造成其基因功能研究長(zhǎng)期落后于其他模式昆蟲的主要原因。盡管已經(jīng)有很多研究者探索適合蜜蜂基因組編輯操作的方法，例如：精子介導(dǎo)法、顯微注射法、電穿孔法、轉(zhuǎn)座子載體法、Crispr/Cas9技術(shù)，這些基因編輯的方法都能有助于我們深入研究蜜蜂復(fù)雜的社會(huì)行為和級(jí)型分化現(xiàn)象，同時(shí)也將會(huì)加快優(yōu)良性狀分子育種的進(jìn)程。但是這些方法都建立在取得完好的蜂卵上。特別是取得1小時(shí)及1小時(shí)內(nèi)的蜂卵。一方面有成千上萬只蜜蜂保護(hù)的蜂卵不像其它產(chǎn)在樹葉下或水塘邊的昆蟲卵對(duì)惡劣的環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，一旦長(zhǎng)時(shí)間離開蜂群，蜂卵很容易死亡或者發(fā)育不正常。另一方面，蜂卵的卵殼較薄且有韌性，黏在巢房底部很難操作。即便能通過取卵工具將蜂卵取出轉(zhuǎn)移，也很難保證有較高的孵化率。在體式顯微鏡下觀察這些未孵化的蜂卵，可以看到蜂卵體表有一些機(jī)械傷口，這些傷口是肉眼所看不到的。所以要大量取1小時(shí)內(nèi)的蜂卵進(jìn)行轉(zhuǎn)移并保證90%以上的孵化率成為阻礙科研人員進(jìn)行蜂卵研究的主要難題。此難題若無法突破，即便是高效便捷的Crispr/Cas9技術(shù)也無法在蜜蜂中開展應(yīng)用，而想通過蜜蜂基因組編輯技術(shù)加快蜜蜂優(yōu)良性狀分子篩選以及培育抗病高產(chǎn)新品種的愿望也將夢(mèng)碎于此。甚至阻礙科研人員進(jìn)一步研究蜜蜂復(fù)雜社會(huì)行為與蜜蜂特殊生物學(xué)現(xiàn)象的基礎(chǔ)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于顯微注射的蜜蜂卵移取方法。用于解決大量移取1小時(shí)內(nèi)蜂卵， 且孵化率不低于90%，為蜜蜂育種工作中的蜂卵研究奠定基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明用于顯微注射的蜜蜂卵移取方法，其特征在于移取步驟如下：

（1）在新巢脾上用針式囚王籠限制蜂王24小時(shí)；

（2）將步驟（1）的針式囚王籠轉(zhuǎn)移到該新巢脾的其它位置，限制蜂王產(chǎn)卵1個(gè)小時(shí)；所述其它位置，即除原位置外的任意位置；

（3）割下步驟（2）針式囚王籠下巢脾中的產(chǎn)卵區(qū)，在體式顯微鏡下用移蟲針鏟下帶有蜂卵的蜂蠟，轉(zhuǎn)移出巢房；

（4）另取巢礎(chǔ)，壓成厚度為1mm的薄片，并切成條狀，黏在培養(yǎng)皿上；

（5）將步驟（3）中帶有蜂卵的移蟲針，轉(zhuǎn)移到步驟（4）黏在培養(yǎng)皿上巢礎(chǔ)條的邊緣上，將帶有蜂卵的蜂蠟黏在巢礎(chǔ)條上，即為用于顯微注射的蜜蜂卵。

其中，步驟（1）所述蜂王，選用開始產(chǎn)卵后不超過六個(gè)月、產(chǎn)卵力強(qiáng)的蜂王；

步驟（1）所述新巢脾，選用蜂群剛筑好的新巢脾；

步驟（1）所述的限制蜂王24小時(shí)，限制蜂王的同時(shí)對(duì)蜂群進(jìn)行獎(jiǎng)勵(lì)飼喂。

所述巢脾、針式囚王籠、巢礎(chǔ)、移蟲針、培養(yǎng)皿均由市場(chǎng)購(gòu)得。

為了探索不同處理?xiàng)l件對(duì)蜂卵孵化率的影響，我們對(duì)轉(zhuǎn)移的蜂卵和注射無菌水的蜂卵進(jìn)行孵化數(shù)目統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 不同處理?xiàng)l件對(duì)蜂卵孵化率的影響