[發(fā)明專利]檢測犬艾利希體的引物對、套組及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710703442.6
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107828903A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張勇;趙芷郁;羅加惞
• 申請（專利權(quán)）人: 臺達(dá)電子國際（新加坡）私人有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 隆天知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司72003
• 代理人: 王芝艷,吳小瑛

【技術(shù)領(lǐng)域】

本申請系關(guān)于一種犬艾利希體的快速診斷，尤指一種檢測犬艾利希體的引物對、套組及方法。

【先前技術(shù)】

犬艾利希體(Ehrlichia Canis)為一小型、桿狀、細(xì)胞內(nèi)寄生且由壁虱傳播的病原體，革蘭氏染色呈陰性，屬于α-變形菌(α-proteobacterium)，且主要由棕色犬壁虱(brown dog tick，學(xué)名為Rhipicephalus sanguineus)所傳播。此病原體呈微菌落方式寄生在以薄膜區(qū)隔的細(xì)胞內(nèi)液泡，且主要寄生在哺乳類宿主的單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中。艾利希體(Ehrlichia)與立克次體(Rickettsia)、無形體(Anaplasma)及沃爾巴克氏體(Wolbachia)是非常接近的菌種，且具有類似的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

犬艾利希體最早于公元1935年在阿爾及利亞被發(fā)現(xiàn)，且目前所知已廣泛分布在美國、歐洲、南美洲及亞洲。犬艾利希體會造成犬只的艾利希體癥(ehrlichiosis)，其系經(jīng)由壁虱傳播而感染，而感染的犬只若未受治療，可能成為無癥狀的帶原者長達(dá)數(shù)年，且最后因大量出血而死亡。艾利希體癥會影響犬只、人類及其他馴養(yǎng)或野生的動物品種。隨著全球暖化、壁虱分布區(qū)域的擴(kuò)大及國際旅行的增加，此疾病也可能會散播至過去非流行的區(qū)域。

艾利希體癥可產(chǎn)生多重有臨床癥狀或無臨床癥狀的表現(xiàn)，使得此疾病的診斷富有挑戰(zhàn)性。急性和慢性期以及與其他蜱媒病原體的共同感染，也使得治療更加復(fù)雜。盡管用抗生素治療且臨床癥狀已解除，通常病原體也無法被完全消除。

由于這些感染通常會造成血小板低下癥，因此血小板計(jì)數(shù)是重要的篩檢試驗(yàn)，然而少量的病原體增加了試驗(yàn)的困難度，故此診斷方法缺乏靈敏度。而其他用于犬艾利希體診斷的方法尚包括血液抹片、血清診斷及分子診斷，但前述方法皆有其限制。

利用血液抹片鏡檢來檢測典型細(xì)胞內(nèi)寄生的犬艾利希體之桑葚胚對于艾利希體癥的診斷是具有高度專一性的，然而此方法相當(dāng)費(fèi)時且不是非常可靠，因?yàn)樵诩毙愿腥酒陂g，桑葚胚在血液抹片中僅有小量的存在，而此鏡檢的靈敏度僅有約4％。

血清診斷則有助于辨識犬艾利希體抗體的存在，但可能無法偵測出疾病急性期的早期感染。血清診斷的限制更在于交叉反應(yīng)，尤其常見于艾利希體屬(Ehrlichia spp.)及無形體屬(Anaplasma spp.)之間。此外，血清診斷也無法區(qū)分出是曾經(jīng)感染(post exposure)或是正在感染(present infection)。

而診斷犬艾利希體最佳的方式便是分子診斷，尤其是利用聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)進(jìn)行檢測。聚合酶連鎖反應(yīng)是一種更靈敏且更具專一性的技術(shù)，提供了診斷犬艾利希體的另一替代方案。舉例而言，由BioinGentech公司所提供的犬艾利希體檢測套組(VetPCR Ehrlichia canis Detection Kit)可用來檢測犬艾利希體感染，且診斷快速、準(zhǔn)確及可靠。然而，此檢測套組仍須結(jié)合終端PCR偵測方法，例如凝膠電泳(gel electrophoresis)，使得整個檢測過程需花費(fèi)3小時，仍是相當(dāng)費(fèi)時及費(fèi)力。

因此，提供一種可改善現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)之犬艾利希體診斷方法實(shí)為本領(lǐng)域技術(shù)人員需要努力的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

本申請的目的在于提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis)的引物對，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準(zhǔn)確的診斷出犬艾利希體感染。

本申請的另一目的在于提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis)的套組，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準(zhǔn)確的診斷出犬艾利希體感染。

本申請的又一目的在于提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis)的方法，其具高靈敏性及高專一性，以快速且準(zhǔn)確的診斷出犬艾利希體感染。

為達(dá)上述目的，本申請之一較廣義實(shí)施方案為提供一種用以檢測犬艾利希體(Ehrlichia Canis)的引物對，包含一順向引物及一逆向引物，其中，該順向引物的序列為5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，該逆向引物的序列為5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’。該順向引物及該逆向引物系用于實(shí)時聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Real-time PCR)。