[發明專利]攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇報告病毒的制備方法及其產品和應用

有效

• 申請號: 201710702634.5
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107475294B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 陳舜;賀煜;程安春;汪銘書
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/53;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/66;C12R1/93
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發明涉及一種攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇報告病毒的構建方法及其產品和應用，將帶鴨坦布蘇病毒全長cDNA的感染性克隆的質粒經過改造，將海腎熒光素酶的基因插入到TMUV病毒的5’UTR和結構基因之間，構建出插入了RLuc基因的全長TMUV報告病毒的感染性克隆的質粒，再用高質量的自動加帽的T7體外轉錄試劑盒，獲得報告病毒的轉錄本后，轉染BHK21細胞拯救出報告病毒，由于海腎熒光素酶具有出色的靈敏度、使用方便、可以定量檢測，因而可以通過檢測RLuc的活性來反映病毒的復制情況，可用于研究TMUV的生命周期、復制機制，抗TMUV試驗，病毒蛋白與宿主的相互作用等多方面的機制等多方面的研究。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇報告病毒的構建方法，還涉及由該方法制得產品及產品的應用。

背景技術

我國是世界養禽大國，更是世界最大的養鴨國。鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusuvirus，DTMUV)病自2010年首次爆發以來，給我國的養鴨產業造成了巨大的經濟損失。幾乎所有品種的鴨都能感染鴨坦布蘇病毒，包括櫻桃谷鴨、北京鴨、麻鴨等，其主要臨床癥狀為：體溫升高、食欲顯著下降，四肢無力、癱瘓；產蛋大幅下降，排草綠色稀便，氣味惡臭；雛鴨感染后以癱瘓、頭頸震顫為特征。種鴨感染后，其特征性病變為卵泡膜出血，卵泡變形甚至破裂，所以該病曾被稱為“出血性卵巢炎”，蛋鴨產蛋量大幅度下降甚至停止產蛋，嚴重者能夠導致死亡，死亡率可以達到10％-30％。剖檢時可以見到脾臟明顯腫大，另外部分鴨肝臟出血嚴重，并同時伴有針尖狀白色壞死點；卵巢病理變化非常嚴重，出血、萎縮、破裂，輸卵管有大量粘液。此外，有報道雞、鵝、麻雀等也能感染該病。

DTMUV屬黃病毒科，黃病毒屬，基因組為不分節段的單股正鏈RNA，約由10990個核苷酸組成，包含一個開放閱讀框，編碼一個3425aa的多聚蛋白。在宿主信號肽酶和病毒自身蛋白酶NS2B/NS3的切割作用下，產生3個結構蛋白(capsid[C]蛋白，premembrane[prM]蛋白，envelope[E]蛋白)，和7個非結構蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5；兩端被5’UTR和3’UTR結構包圍，分別長約94nt和618nt，病毒基因組RNA的5’端有帽子結構，3’端無poly(A)結構。

目前的研究對DTMUV的研究并不深入，報道主要集中與病毒的分離及鑒定。其致病機制，免疫逃避等分子機制，各種蛋白的結構功能還有待于進一步的研究，才能確定與其他黃病毒屬是否一致，是否存在差異性，而有關鴨坦布蘇病毒的各個蛋白的作用也還有待深入的研究與證明。由于當前對該病的防控措施尚不完善，因此，該病每年仍對我國養鴨業造成幾十億元的經濟損失，切實安全、高效的DTMUV疫苗亟待研制和應用。

經典遺傳學遵循從生物的表型、性狀再到遺傳物質的研究路線，來研究生命發生、發展的規律。而反向遺傳學(reverse genetics)技術開辟了另外一條研究思路，即從遺傳物質向生物性狀、表型進行研究的手段。狹義的反向遺傳學特指針對微生物的反向遺傳操作，尤其是病毒的反向遺傳操作，在RNA病毒研究中亦稱作RNA感染性克隆技術。該方法具有定點改變、操作可控等優點。由于多數基因工程技術主要以DNA為對象，較DNA病毒研究而言，RNA病毒的反向遺傳操作更為復雜，難度更大。針對不同的RNA病毒其反向遺傳操作技術手段也不一。目前，多種RNA病毒的感染性克隆已成功構建，該技術的應用對于病毒學研究具有重大的推動作用。