[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)化油菜的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710702150.0
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107475174B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉雁華;李運亭;賈志偉;宋慶芳
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/20
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化油菜的方法，包括油菜種子萌發(fā)后獲得下胚軸或其切段；農(nóng)桿菌菌株侵染所述下胚軸或其切段；將侵染后的所述下胚軸或其切段進行愈傷誘導培養(yǎng)；利用選擇劑對上述油菜愈傷組織進行篩選培養(yǎng)，將篩選后的油菜抗性愈傷組織在含有ZT的分化培養(yǎng)基上進行芽分化培養(yǎng)；由上述油菜芽生出的油菜小苗依次在含有細胞分裂素和生長素的第一生根培養(yǎng)基和不含任何激素的第二生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明愈傷誘導率高，芽分化率高，易于生根且植株成活率高，轉(zhuǎn)化效率高達到8％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種油菜轉(zhuǎn)化和培育的方法。

背景技術(shù)

油菜是十字花科蕓薹屬植物，分為白菜型(Brassica rapa L.)、芥菜型(BrassicaJuncea L.)和甘藍型(Brassica napu L.)3種栽培品種，其中甘藍型油菜在全球的種植面積最為廣泛，芥菜型次之，白菜型最少。目前，油菜作為四大油料作物之一，是全球種植面積第四大的轉(zhuǎn)基因作物，2010年全球轉(zhuǎn)基因油菜的種植面積占全球油菜種植總面積的23％，達到700萬hm²，并逐年增加。自1985年Ooms等首次利用農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因油菜以來，油菜轉(zhuǎn)基因研究已在抗病、抗蟲、耐受除草劑、雄性不育、蛋白組分改良等多方面取得了突破性進展。

良好的受體系統(tǒng)是油菜遺傳轉(zhuǎn)化的一個重要環(huán)節(jié)，關(guān)系到提供適宜轉(zhuǎn)化的受體材料以及轉(zhuǎn)化后的細胞能否再生為正常植株等問題。迄今為止，適合油菜轉(zhuǎn)化的受體材料包括下胚軸、子葉柄、莖段、原生質(zhì)體、小孢子等。與此同時，油菜的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導法、基因槍轟擊法、電擊法、PEG法和花粉管通道法等，其中農(nóng)桿菌介導法和基因槍轟擊法為目前常用的轉(zhuǎn)基因方法。

最早Ooms等(Ooms G,et al.Theor Appl Genet,1985,71:325-329)和Fry(Fry J,et al.Plant Cell Rep,1987,6:321-325)分別用無菌苗的莖段和花莖建立了根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系，但轉(zhuǎn)化效率不高。1989年Moloney等首次利用甘藍型春油菜品種“westar”的子葉柄建立了高效的根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化效率達到55％(Moloney,etal.1989.Plant Cell Rep.8:238-242)，但由其獲得的再生植株易為嵌合體，基因型也可能是雜合的。隨后各國研究表明“westar”的確易于轉(zhuǎn)化，但Moloney等的高效油菜轉(zhuǎn)化體系的重復性低(郭學蘭，王漢中。中國油料作物學報，1999，21(3):1-5)，目前大部分研究報道的轉(zhuǎn)化效率不超過1％。

下胚軸也是常用的甘藍型油菜轉(zhuǎn)化受體。Radke等的研究發(fā)現(xiàn)使用甘藍型春油菜“westar”的下胚軸作為外植體轉(zhuǎn)化時，其轉(zhuǎn)化效率約為2.5％(Radke SE,etal.Theor.Appl.Genet.1988,75:685-694.)。目前被廣泛使用的下胚軸轉(zhuǎn)化程序主要根據(jù)De Block等人(De Block M,et al.Plant Physiol,1989,91:694-701)建立的方法。但是這類方法也存在一定的缺陷：下胚軸一般很難從切口處直接再生出不定芽，必須經(jīng)過愈傷組織階段的誘導，且生根難、轉(zhuǎn)化效率低；同時冬油菜的遺傳轉(zhuǎn)化還存在外植體褐化的問題，嚴重影響后續(xù)的再生和轉(zhuǎn)化。

原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化是針對單個的植物細胞，而不是多細胞的組織和器官，可以避免產(chǎn)生嵌合體。1994年程振東等利用PEG的方法將GUS基因?qū)敫仕{型油菜栽培品種“云北二號“的原生質(zhì)體中(程振東，衛(wèi)志明，許智宏。1994.實驗生物學報，37(3):341-351)。但是這種轉(zhuǎn)化方法受到諸多因素的影響，如PEG的pH值、原生質(zhì)體的懸浮液組份、外源DNA加入的時間、抗生素篩選的時間以及轉(zhuǎn)化品種基因型和原生質(zhì)體再生能力等。由于轉(zhuǎn)化處理會使原生質(zhì)體受到傷害，因而大大降低細胞分裂的速度，且實驗的重復性較差，轉(zhuǎn)化效率低。