[發明專利]CRISPR/Cas9技術介導miR167前體序列編輯體系的建立方法

在審

• 申請號: 201710698186.6
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107815463A
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 王小柯;江東
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/113
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

技術領域

本發明涉及到利用CRISPR/Cas9技術對番茄、柑橘等植物miR167前體序列進行編輯的方法的建立。

背景技術

CRISPR/Cas9技術作為一門新興的基因編輯技術，可以實現在基因組水平上對目標基因定點修飾，產生的突變可以遺傳，近些年來逐漸成為分子生物學研究的熱點。CRISPR/Cas9技術的基本原理是設計一段gRNA序列，與Cas9蛋白形成核酸蛋白復合體，該復合體可以在體內或者體外對靶標基因的特定位點進行切割，造成雙鏈DNA斷裂，在DNA自我修復過程中引入堿基的缺失或者插入。CRISPR/Cas9技術因其載體組裝簡便、通用性強以及使用門檻低等特點已經在動植物中得到廣泛應用。目前用于研究的CRISPR/Cas9載體有很多，其基本結構單元是gRNA和Cas9，還有一些標記篩選位點。gRNA設計的嚴謹性是該技術成功的關鍵點之一，不同的靶位點之間突變效率有很大差異，因此選擇合適的靶位點尤為重要。目前已經有多個在線網站提供植物gRNA的設計，但網站設計有一定的缺陷，不能準確得到合適的gRNA。關于CRISPR/Cas9基因組編輯突變的檢測方法也比較多，大多數是應用限制性內切酶和PCR測序相結合的方法檢測突變效率，其工作量大且成本高。

現有技術中，gRNA的設計方法是直接采用在線軟件設計，輸入一段長度為23-5000bp的序列，軟件自動找出序列上所有能夠設計gRNA的靶標位點并按照打分高低排列，根據軟件給出的評分，選擇評分較高的gRNA序列用于構建CRISPR/Cas9載體。載體的結構：一般包含gRNA和Cas9，gRNA的啟動子有常用的U6或U3啟動子以及物種特異性啟動子，Cas9大多數使用CaMV 35S啟動子驅動。除此之外載體上還含有抗性篩選標記。這兩張方法存在的問題是：1、直接使用在線軟件設計gRNA，不同軟件的評分標準不同，評分排名會有變化，依據此方法得到的評分較高的gRNA也會不一樣，設計出的gRNA在體內可能與靶位點的結合能力較弱，這對后續靶位點的編輯存在很大影響。因此僅用軟件設計gRNA后隨即選擇得分較高的gRNA構建載體，后續的基因編輯成功率得不到保障。載體在轉染植株后，有可能不會發生編輯，這主要是gRNA在設計后缺乏有效驗證。2、載體結構中若只含有抗性篩選標記，后續的檢測工作較麻煩，不能更有效的鑒定載體是否成功轉入到植株中。

發明內容

本發明基于上述情況，改進相關關鍵點，利用CRISPR/Cas9技術成功編輯了番茄的miR167前體序列。其中的gRNA設計方面采用在線軟件設計和體外酶切檢測相結合的方法，同時在載體上插入一個CFP熒光蛋白位點，便于后期對突變體植株的檢測和篩選。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種CRISPR/Cas9技術介導miR167前體序列編輯體系的建立方法，其特征在于，步驟包括：

A、gRNA設計和體外驗證：利用在線軟件設計后選擇評分較高的多個靶標位點，序列合成后使用體外酶切檢測的方法來篩選合適的gRNA，通過T7RNA聚合酶將軟件設計出的靶標位點序列在體外轉錄生成gRNA，再利用Cas9核酸酶體外切割的方法來驗證gRNA-Cas9的體外切割效率，從而篩選出目的gRNA；

B、載體構建：構建CRISPR/Cas9表達系統的兩個載體pP1C.5和pP1C.1

通過pUC19載體改造pP1C.5載體，使其含有AtU6啟動子驅動的gRNA插入位點和sgRNA scaffold；通過pCAMBIA1302載體改造pP1C.1載體，使其含有CaMV 35S啟動子驅動的Cas9，同時含有hptⅡ潮霉素篩選位點，并將潮霉素篩選位點替換成卡那霉素篩選位點，并加上CFP熒光蛋白的基因，重新命名為pP1C.1C。

進一步的，步驟(1)中，gRNA體外驗證中，所用的擴增引物，上游引物T7-gRNA-FPg：TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC，下游引物gRNA-RP：AGCACCGACTCGGTGCCACTT；其中NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是gRNA靶點，不帶PAM序列。