[發(fā)明專利]一種用于檢測CYP2C19基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710697756.X
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107287339A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉沛;王林海
• 申請（專利權(quán)）人: 北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京同輝知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11357
• 代理人: 孫艷敏,楊敬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測CYP2C19基因多態(tài)性的技術(shù)。

背景技術(shù)

氯吡格雷(Clopidogrel)，屬于噻吩吡啶類抗血小板藥物，第二代ADP受體拮抗劑。氯吡格雷為無活性的藥物前體，需經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P450酶系活化，其中約85％被酯化為無活性的代謝產(chǎn)物經(jīng)腸道代謝，僅有約15％氯吡格雷被活化生成具有活性的代謝產(chǎn)物發(fā)揮其抗血小板藥理作用。

氯吡格雷是治療急性冠狀動脈綜合征和經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后抗栓的基礎(chǔ)藥物，但4％～30％患者在治療期間出現(xiàn)氯吡格雷療效下降，甚至出現(xiàn)氯吡格雷抵抗。氯吡格雷為前體藥，主要依賴于CYP2C19代謝生成活性代謝產(chǎn)物，發(fā)揮抗血小板療效。CYP2C19基因存在多態(tài)性，其酶有四種不同的代謝類型：快代謝型(RM，*1/*1)；超快代謝型(UM，*17/*17)；中間代謝型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)；慢代謝型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)。中國人群中14％為CYP2C19慢代謝型，常規(guī)劑量的氯吡格雷在慢代謝型患者中產(chǎn)生的活性代謝物減少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓風(fēng)險增加；而在超快代謝型患者中產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物增加，抑制血小板聚集作用增強，出血風(fēng)險增加。2010年美國FDA修改的氯吡格雷說明書中黑框警示：CYP2C19基因型檢測結(jié)果應(yīng)作為醫(yī)生調(diào)整治療策略的參考，對于CYP2C19PM型患者，建議考慮調(diào)整治療方案或治療策略。

人CYP2C19基因具有遺傳多態(tài)性，CYP2C19至少有36種等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3占亞洲人群弱代謝表型的99％以上，CYP2C19*17是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有超快活性的基因分型。2010年FDA提出黑框警告，明確建議醫(yī)生對將要服用氯吡格雷的患者進行CYP2C19基因分型檢測，針對患者基因型實施個性化用藥。臨床研究表明，CYP2C19基因突變導(dǎo)致的弱代謝個體，栓塞重新形成的風(fēng)險增加，心腦血管事件的發(fā)生風(fēng)險增加，病死率升高。對于這類個體，需要增加氯吡格雷的劑量(負(fù)荷劑量為300mg或600mg)，以達(dá)到阻斷血小板聚集的效果。CYP2C19功能缺失性等位基因攜帶者的心血管事件和中風(fēng)的死亡率增加51％(12.1％vs.8.0％)。

因此，CYP2C19基因多態(tài)性檢測對于氯吡格雷用藥有重要意義。而目前檢測CYP2C19基因多態(tài)性的核苷酸引物及方法準(zhǔn)確性和特異性較低，難以在臨床廣泛應(yīng)用。所以探索一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性快速可靠的核苷酸引物組及方法已經(jīng)成為臨床實驗研究的熱點問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測CYP2C19基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用，通過調(diào)整引物的配比、Taq酶的用量和鎂離子的用量等，通過FAM、HEX、ROX(修飾)三通道多重PCR反應(yīng)，并且將引物放置到一管內(nèi)分型檢測，提高檢測的簡便性和特異性，使得整個操作以及反應(yīng)過程簡單化。并在此基礎(chǔ)上，對探針進行鎖核酸修飾和二級結(jié)構(gòu)修飾，增加探針的Tm值，進一步提高探針結(jié)合的特異性的，最后通過上述體系的調(diào)整，使得準(zhǔn)確性和特異性均能夠達(dá)到100％，最低檢測濃度能夠達(dá)到1ng/μL，解決了以往檢測CYP2C19基因多態(tài)性時準(zhǔn)確性和特異性較低的問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種用于檢測CYP2C19基因多態(tài)性的組合物，包括針對用于檢測待檢樣品中與CYP2C19基因相關(guān)的特異性目的基因的引物對和探針，包括：

CYP2C19*2引物：

CYP2C19*2基因正向引物(CYP2C19*2-F):ATTATTGTTTTCTCTTAGATAT(SEQ ID NO.1)；

CYP2C19*2基因反向引物(CYP2C19*2-R):TCTCCAAAATATCACTTTC(SEQ ID NO.2)；

探針CYP2C19*2-GFP：FAM-TGGGTTATTTCCCGGGAACCCA-BHQ1(SEQ ID NO.3)；

探針CYP2C19*2-AFP：ROX-GTTATTCCCAGGAACCCATAAC-BHQ2(SEQ ID NO.4)；

CYP2C19*3引物對：

CYP2C19*3基因正向引物(CYP2C19*3-F):TTAACTTGATGGAAAAA(SEQ ID NO.5)；

CYP2C19*3基因反向引物(CYP2C19*3-R):GACTGTAAGTGGTTTCT(SEQ ID NO.6)；