[發明專利]重組型耐熱DNA聚合酶及其應用

有效

• 申請號: 201710695807.5
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107475216B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 史進
• 申請（專利權）人: 北京擎科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12Q1/6869
• 代理公司: 合肥市科融知識產權代理事務所(普通合伙) 34126
• 代理人: 陳思聰

本發明涉及一種重組型耐熱DNA聚合酶：包括DNA結合結構域、蛋白結構域連接接頭以及無3’?5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，DNA結合結構域通過蛋白結構域連接接頭連接到無3’?5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶的N端，其中DNA結合結構域為Sso7d結構域、HMf類蛋白或來自甲烷嗜熱菌的DNA拓撲異構酶Ⅴ的HhH結構域；無3’?5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶為Taq、Tth、Tma、Pfu、Deep、Vent或Tgo DNA聚合酶的缺失突變體。本發明還提供了上述重組型耐熱DNA聚合酶在DNA測序中的應用。本發明的重組型耐熱DNA聚合酶的續進性和延伸速度明顯增強，在PCArg反應測序過程中，節約時間，使用本發明中的測序酶，可以獲得更長的讀長，以及更高的測序成功率。

技術領域

本發明涉及酶工程領域，尤其涉及一種重組型耐熱DNA聚合酶及其應用。

背景技術

在測序應用上需要提高聚合酶的效率。通常DNA測序依靠生成四種不同類型的單鏈 DNA片段庫來實現，單鏈DNA片段的一端是確定不變的，而另一端終止于不同的核苷酸(鳥嘌呤核苷酸G，腺嘌呤核苷酸A，胸腺嘧啶核苷酸T，胞嘧啶核苷酸C)。四種不同類型的DNA片段基于長度大小而被分離，在高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠上呈現不同的條帶，每個條帶線性地對應DNA序列中的每一個特定的核苷酸，從而鑒定出給定的單核苷酸在序列中的位置。目前DNA測序主要有兩種方法：Maxam和Gilbert的化學法和Sanger的雙脫氧核苷酸終止法。

天然聚合酶的許多特性不適合DNA測序，測序酶應該具備的特性包括：(1)較高的持續合成能力：持續合成能力是指酶從引物-模板退火復合物上脫離之前鏈持續延伸的程度。(2) 耐熱性：在高溫條件下抵抗失活或分解的能力是酶在現代高技術投入循環測序反應中的最重要的因素。(3)核苷酸類似物嵌入染色末端：嵌入類似物的能力對雙脫氧鏈終止法起決定性因素。帶每個標記染料末端的終止的效率必須與避免低質量的不均勻峰數據的效率相似。此外，聚合酶經常有3’-核酸外切酶“校正”和/或在DNA復制后切掉引物的5’-核酸外切酶能力。由于這兩種能力都不是測序所需的，所以聚合酶的突變體中應將其去除。

自動測序的發展催生了對更好的測序酶的追求，但目前應用于測序反應的酶效率不高，缺失型Taq酶去除了5’-3’外切酶活性，續進性只有2個堿基左右。DNA聚合酶的續進性(Processivity)即每次聚合酶結合引物-模板復合體后催化合成的寡核苷酸的數量，這一性能可通過增強酶-核酸復合體的穩定來實現增強。另外，測序酶過早地脫離模板會導致通過測序反應無法得到可靠的序列信息。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種重組型耐熱DNA聚合酶及其應用，本發明的重組型耐熱DNA聚合酶的續進性明顯增強，具有極快的延伸速度，在PCR反應測序過程中，節約時間，使用本發明中的測序酶，可以獲得更長的讀長，以及更高的測序成功率。

本發明提供了一種重組型耐熱DNA聚合酶，包括DNA結合結構域、蛋白結構域連接接頭(linker)以及無3’-5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，DNA結合結構域通過蛋白結構域連接接頭連接到無3’-5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶的N端，其中

DNA結合結構域為Sso7d結構域、來自耐熱菌的HMf類蛋白或來自甲烷嗜熱菌的DNA拓撲異構酶Ⅴ的HhH結構域；

無3’-5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶缺失突變體、Tth DNA聚合酶缺失突變體、Tma DNA聚合酶缺失突變體、Pfu DNA聚合酶缺失突變體、Deep VentDNA 聚合酶缺失突變體、Vent DNA聚合酶缺失突變體或Tgo DNA聚合酶缺失突變體。優選地， DNA結合結構域為Sso7d結構域。優選地，無3’-5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶缺失突變體。

進一步地，Sso7d結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。