[發(fā)明專利]一種高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710692347.0
• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN109385446B
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邢邯;黃顏眾;軒慧冬;郭娜;黃鷺;王海棠
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;杜靜

1.一種高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

1）獲得攜帶目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌菌苔，利用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基懸浮菌苔，調(diào)節(jié)OD600值在0.6～1.0；所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配比為：CCM基本培養(yǎng)基中加入0.03～0.05g/L乙酰丁香酮、0.2～0.3mg/L赤霉素、0.15～0.16g/L二硫蘇糖醇、55～60mg/L的L-半胱氨酸和120～122g/L的NaOH；其中每升的CCM基本培養(yǎng)基的配比為0.1×B5鹽，0.1×B5有機(jī)，MES3.9g，蔗糖30g，pH5.4；

2）將在萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)的大豆種子沿種臍剖開獲得半種子，將胚芽去除后將半種子放入步驟1）制備的含有懸浮菌苔的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，侵染15～30min ；

3）步驟2）侵染后的半種子布于空培養(yǎng)容器中，23～25℃黑暗共培養(yǎng)3～5天；

4）步驟3）共培養(yǎng)后的半種子切去根部只保留距胚軸0.8～1.2cm的下胚軸，布于培養(yǎng)基中，23～25℃黑暗培養(yǎng)，長出根后，選取長度為4～6cm的陽性根切下單獨培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟1）所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配比為：CCM基本培養(yǎng)基中加入0.04g/L乙酰丁香酮、0.25mg/L赤霉素、0.154g/L二硫蘇糖醇、58mg/L的L-半胱氨酸和120g/L的NaOH。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2）中侵染條件為70～90rpm搖床中侵染15～30min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2）中萌發(fā)培養(yǎng)基為GM固體培養(yǎng)基；每升的GM固體培養(yǎng)基的配比為1×B5鹽，1×B5有機(jī)，1×鐵鹽，蔗糖20g，瓊脂8g，pH5.8。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2）中大豆種子萌發(fā)的方法：滅菌的大豆種子種臍向下插入萌發(fā)培養(yǎng)基至種子2/3處，23～25°C黑暗培養(yǎng)15～17h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟3）中侵染后的半種子去除種皮后布于空培養(yǎng)容器中，23～25℃黑暗共培養(yǎng)3～5天。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟3）中侵染后的半種子去除種皮后，曲面向下布于空培養(yǎng)容器中，23℃黑暗共培養(yǎng)5天。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆根毛轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟4）中所用的培養(yǎng)基為white培養(yǎng)基。