[發明專利]一種重組腫瘤抗原其制備方法和編碼核酸及其應用

在審

• 申請號: 201710691036.2
• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN107793484A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京啟辰生生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及含有抗原的醫藥制品領域，具體地，是一種重組腫瘤抗原其制備方法和編碼核酸及其用途。

背景技術

癌癥的傳統治療手段如：手術治療、放射治療和化療等，均具有一定的局限性。手術治療只適合早期腫瘤；而放療和化療由于靶向性較差，易損傷正常細胞，產生不良反應。惡性腫瘤具有易侵襲和易復發的生物學特征，因此需要靶向性更好、毒性更小的治療方案。隨著腫瘤學的發展，生物免疫療法成為腫瘤治療的第四種手段。有研究證明，腫瘤細胞具有特異性的腫瘤抗原，免疫系統能通過識別腫瘤抗原區別腫瘤細胞和正常細胞。在腫瘤患者中，免疫系統受到抑制，無法正常識別腫瘤細胞表面的腫瘤抗原，進而有效殺傷腫瘤細胞。樹突細胞腫瘤疫苗通過特異性的、具有免疫原性的腫瘤抗原(如：多肽、RNA等)負載樹突細胞，在各種細胞因子、趨化因子等佐劑的輔助下，激活或加強機體自身抗腫瘤免疫，進而殺傷和清除腫瘤細胞。目前，樹突細胞腫瘤疫苗已成為腫瘤治療領域的研究熱點。

AKR1B10又叫做醛糖還原酶相似蛋白-1，小腸還原酶或醛糖還原酶相關蛋白，其基因位于ch7q33，轉錄的產物長為1376bp，含有10個外顯子，AKR1B10蛋白一共有316個氨基酸，其分子量為36.02kDa。AKR1B10基因在人的大多數組織里面不表達，它主要在小腸，結腸和胃里面表達，在肝臟，胸腺，前列腺和睪丸中也有低水平存在。但是在人的肝癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等幾種癌癥中高表達，可以通過解毒細胞內的活性羰基促進腫瘤細胞生長。鑒于此，AKR1B10基因可以做為腫瘤免疫治療的一個靶點，以之作為腫瘤抗原刺激機體，能夠產生細胞毒性T細胞，在不引起自身免疫的情況下即可引起有效的抗腫瘤免疫反應。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種含有AKR1B10基因的腫瘤抗原、編碼核酸及其制備方法，以及將該抗原用于負載樹突細胞，用于主動免疫治療高表達AKR1B10基因的癌癥，包括但不限于肝癌，非小細胞肺癌，乳腺癌等。

本發明是按照以下技術方案實現的：

一種重組含有AKR1B10編碼區的腫瘤抗原，所述的重組抗原包含有：人GP96基因的信號肽序列編碼區，人AKR1B10基因的編碼區，人LAMP1基因信號序列編碼區，以及A64的ployA結構區域。

所述的重組抗原的制備方法，其包括以下步驟：

1)根據Genebank報道的人AKR1B10基因、人gp96基因、人LAMP1基因的編碼序列，根據以下規則，進行密碼子優化：1.選用高GC含量的密碼子，使優化后的核酸序列GC含量在50％～75％；2.去掉稀有密碼子，選用在人源細胞中使用頻率高的密碼子；3.優化去掉可能形成二級結構的核酸序列；4.優化去掉消極的順式作用原件。

2)構建融合表達AKR1B10抗原以及促進抗原呈遞的信號肽的重組質粒，含有AKR1B10基因的核酸序列如核酸序列表所示：

3)將合成的重組載體以限制性內切酶線性化后，采用T7體外轉錄酶體外轉錄合成包含重組AKR1B10基因序列的信使RNA。

附圖說明

圖1是本發明流式細胞儀檢測DC細胞轉染效率圖

圖2是本發明流式細胞儀檢測DC細胞表型圖

圖3是本發明熒光定量PCR法檢測AKR1B10抗原在轉染后DC細胞負載情況圖

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。

實施例一：重組抗原基因的合成以及制備

1.根據前文所述規則，對人AKR1B10基因，gp96基因和LAMP1基因進行密碼子優化，合成優化后的基因，克隆合成后的重組基因到載體psp73上。

2.將合成的載體psp73-AKR1B10轉化大腸桿菌感受態細胞stb13中，過夜培養擴增后，使用無內毒素質粒提取試劑盒提取重組質粒。

3.將提取的重組質粒按照如下體系進行酶切(以100ul體系為例)：10x cutsmart buffer，10ul；重組質粒DNA(1000ng/ul)，50ul；超純水，35ul；SpeI-HF限制性內切酶，5ul。充分混勻后于37℃反應2小時。

4.酶切產物中加入70ul異丙醇，充分混勻后放于-20℃沉淀30分鐘。

5.以14000RPM，4℃離心10分鐘，沉淀DNA。去上清，以1ml 75％乙醇洗沉淀兩次。

6.加入30ul超純水溶解沉淀，以核酸定量儀檢測DNA濃度，用超純水將濃度稀釋到1000ng/ul，得到speI酶線性化的重組質粒。