[發(fā)明專利]一種用于白花蛇舌草遺傳多樣性分析的ISSR分子標(biāo)記方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710689991.2
• 申請(qǐng)日: 2017-08-14
• 公開（公告）號(hào): CN107354217B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田慧;封毅;周敏;高慧新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南寧新途專利代理事務(wù)所(普通合伙) 45119
• 代理人: 周善勇

本發(fā)明提供一種用于白花蛇舌草遺傳多樣性分析的ISSR分子標(biāo)記方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該方法選用四條背景清晰、擴(kuò)增效果好和多態(tài)性高的引物，利用ISSR?PCR反應(yīng)擴(kuò)增所述白花蛇舌草基因組DNA，根據(jù)ISSR?PCR結(jié)果，分析條帶，建立白花蛇舌草的DNA指紋圖譜，構(gòu)建白花蛇舌草的遺傳資源數(shù)據(jù)庫(kù)。本發(fā)明為白花蛇舌草品種鑒定以及遺傳多樣性分析建立了新的方法，有效解決前人在遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建中，庫(kù)的代表性差的問(wèn)題；也解決了已有標(biāo)記技術(shù)在白花蛇舌草遺傳資源方面的不足，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、費(fèi)用低、檢測(cè)程序簡(jiǎn)單和不受環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于白花蛇舌草遺傳多樣性分析的ISSR分子標(biāo)記方法。

背景技術(shù)

白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.為壯族民間常用中草藥，為一年生草本，葉對(duì)生，無(wú)柄；花單生或雙生于葉腋，花梗略粗壯，4數(shù)；蒴果膜質(zhì)，扁球形；廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，多見(jiàn)于水田等濕潤(rùn)的曠地。白花蛇舌草具有清熱解毒、活血化瘀、利水滲濕、消腫止痛的功效，內(nèi)服多用于治療腫瘤、蛇咬傷、小兒疳積；外用主治泡瘡、刀傷、跌打等癥。

白花蛇舌草種質(zhì)資源在DNA分子水平上存在極其豐富的遺傳多樣性。充分了解白花蛇舌草種質(zhì)資源的遺傳多樣性與譜系關(guān)系是種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳育種的基本要求和前提。目前對(duì)白花蛇舌草的研究多集中在形態(tài)學(xué)、化學(xué)、藥理學(xué)；分子方面，有學(xué)者對(duì)白花蛇舌草進(jìn)行了DNA提取的考察，還有學(xué)者利用RAPD、AFLP、ITS序列對(duì)白花蛇舌草進(jìn)行研究。

ISSR 分子標(biāo)記是在SSR 標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù),其基本原理是在SSR的5’或3’端加錨1-4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基，然后以此為引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR 的一段基因組DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP 等分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，與SSR相比，ISSR不需要預(yù)先獲知序列信息而使成本降低，且多態(tài)性更豐富；與RAPD 相比，ISSR 重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，同時(shí)具備RAPD 的簡(jiǎn)便、易操作等特點(diǎn)。目前，還未有學(xué)者利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)白花蛇舌草的遺傳多樣性研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種用于白花蛇舌草遺傳多樣性分析的ISSR分子標(biāo)記方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種用于白花蛇舌草遺傳多樣性分析的ISSR分子標(biāo)記引物體系，所述引物體系的引物為121號(hào)、156號(hào)、157號(hào)和160號(hào)引物；其中，

121號(hào)引物的核苷酸序列為ACACACACACACTC，如SED ID No.1所示；

156號(hào)引物的核苷酸序列為ACACACACACACCT，如SED ID No.2所示；

157號(hào)引物的核苷酸序列為ACACACACACACCG，如SED ID No.3所示；

160號(hào)引物的核苷酸序列為GATGATGATGATGC，如SED ID No.4所示。

優(yōu)選地，利用上述引物體系分析白花蛇舌草遺傳多樣性的方法，具體步驟為：

（1）提取白花蛇舌草的基因組DNA，利用ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增所述白花蛇舌草的基因組DNA；

（2）對(duì)步驟（1）所述PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯色，顯色結(jié)束后，拍照獲取譜帶信息并保存；