[發(fā)明專利]一種利用細(xì)胞傳感器評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710689718.X
• 申請(qǐng)日: 2017-08-14
• 公開（公告）號(hào): CN107449821B
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張萬(wàn)剛;葛慶豐;蔣棟磊;葛攀瑋;周光宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/48
• 分類號(hào): G01N27/48;G01N27/327
• 代理公司: 揚(yáng)州市蘇為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32283
• 代理人: 周全

1.一種利用細(xì)胞傳感器評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法，所述細(xì)胞傳感器包括裸金電極以及固定在裸金電極上的巨噬細(xì)胞RAW264.7，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)、空白：將細(xì)胞傳感器一在37℃下置于Tyrode緩沖液中，然后添加PMA丙二醇甲醚醋酸酯，使PMA濃度為100ng/mL，靜置10分鐘，用PBS緩沖液洗滌2-4次，然后將細(xì)胞傳感器一連接到電化學(xué)工作站；

2)、預(yù)處理：將待測(cè)物與細(xì)胞傳感器二在37℃下置于Tyrode緩沖液中，然后加入PMA，使PMA濃度為100ng/mL，靜置10min，然后用PBS緩沖液洗滌2-4次后，將細(xì)胞傳感器二連接到電化學(xué)工作站；

3)、電化學(xué)檢測(cè)：在含有1.0mM Fe(CN)₆^3-或1.0mM Fe(CN)₆^4-或0.1M PBS的溶液中分別對(duì)細(xì)胞傳感器一和細(xì)胞傳感器二進(jìn)行電化學(xué)方法檢測(cè)，記錄電流信號(hào)并分別讀取峰值電流記為I₀和I_S；

4)、判斷待測(cè)物是否具有抗氧化能力：

4.1)當(dāng)I₀＞I_S時(shí)，說(shuō)明該待測(cè)物具有抗氧化性，進(jìn)而進(jìn)入步驟5)評(píng)價(jià)其抗氧化能力；

4.2)當(dāng)I₀≤I_S時(shí)，說(shuō)明該待測(cè)物沒有抗氧化性；

5)評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化能力：通過(guò)計(jì)算相對(duì)抗氧化能力值(RAC)來(lái)評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化能力，相對(duì)抗氧化能力值通過(guò)以下公式計(jì)算：

其中RAC指的是相對(duì)抗氧化能力值，I₀是用100ng/mL PMA刺激時(shí)的峰值電流，I_S是在待測(cè)物保護(hù)作用下的峰值電流，I是沒有PMA刺激的峰值電流。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)胞傳感器評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法，其特征在于，所述細(xì)胞傳感器的制備方法包括如下步驟：

a)、酸化二氧化錳的制備：將MnO₂在超聲波浴中溶解在濃H₂SO₄和濃HNO₃的組合酸液中得到混合液，然后將混合液在冰浴中攪拌3-5h，離心，洗滌和干燥后，得到a-MnO₂納米材料；

b)、修飾電極的制備：將a-MnO₂納米材料在超聲波下分散在殼聚糖溶液中得到固相濃度為0.9-1.1mg/mL的懸浮液，然后取8-12μL懸浮液滴在干燥的金電極表面上，4-6℃條件下干燥后得修飾電極；

c)、混合凝膠的制備：將氧化石墨烯與濃度為10mmol/L的DMEM培養(yǎng)液按質(zhì)量體積比為0.1g：100mL的比例混合，超聲處理4-6min，使得氧化石墨烯均勻地分散在DMEM高糖培養(yǎng)液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1％海藻酸鈉的DMEM培養(yǎng)液中滴加占DMEM培養(yǎng)液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸鈉/氧化石墨烯混合凝膠；

d)、巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：在37℃、CO₂含量為5％的培養(yǎng)環(huán)境中，于含有體積濃度為10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞2-3天，得到巨噬細(xì)胞懸浮液；

e)、細(xì)胞固定：將細(xì)胞懸浮液與混合凝膠按體積比1:1混合，混勻后吸取4-6μL混合了細(xì)胞的凝膠滴加在修飾電極的表面，然后浸沒于CaCl₂溶液中進(jìn)行固定，固定3-5min，并置于5％CO₂的37℃培養(yǎng)箱孵育2-4min，制備得到細(xì)胞傳感器。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用細(xì)胞傳感器評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法，其特征在于，所述細(xì)胞傳感器的制備方法還包括如下步驟：

清潔：將步驟e)制得的細(xì)胞傳感器置于Piranha溶液中浸泡12-18min后分別用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃拋光粉末將電極表面打磨拋成鏡面，再用5％的稀硫酸、無(wú)水乙醇、超純水依次超聲清洗5-8min，氮?dú)獯蹈桑?℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>