[發(fā)明專利]采用大腸埃希氏菌JL-HYP發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸的方法

有效

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• 申請日: 2017-08-12
• 公開（公告）號: CN107435057B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉帥;王衛(wèi)富;謝沛;劉曉東;劉小都;李靜
• 申請（專利權(quán)）人: 河南巨龍生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12P13/24
• 分類號: C12P13/24;C07D207/16;C12R1/19
• 代理公司: 洛陽公信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 41120
• 代理人: 程茗

本發(fā)明涉及采用大腸埃希氏菌JL?HYP發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸的方法，包括以下步驟，大腸埃希氏菌JL?HYP菌株經(jīng)斜面活化，再經(jīng)梯度稀釋，涂布于LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，挑取單個菌落分別接種到LB斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱30?36℃培養(yǎng)12h；從LB斜面培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種到裝有種子培養(yǎng)基的種子瓶中培養(yǎng)；將種子液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)30?45h，得到含有羥脯氨酸的發(fā)酵液；提取含有羥脯氨酸的發(fā)酵液中的羥脯氨酸；本發(fā)明該工藝發(fā)酵周期短，菌體密度高，羥脯氨酸的產(chǎn)量和得率高。本發(fā)明發(fā)酵周期短，菌體密度高，羥脯氨酸的產(chǎn)量和得率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)羥脯氨酸的方法，具體的說是采用大腸埃希氏菌JL-HYP發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸的方法。

背景技術(shù)

羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)為亞氨基酸，全名為，順式-4-羥基-L-脯氨酸;是L-脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物，其分子式為C₅H₉NO₃。羥脯氨酸呈白色片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，微甜，熔點為274℃，易溶于水，微溶于乙醇。

目前，國內(nèi)外報道的生產(chǎn)羥脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法四種，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工業(yè)生產(chǎn)方法。但是，蛋白水解提取法需經(jīng)過強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理，純化步驟長，而且羥脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不僅浪費大量原料，而且廢棄物污染嚴(yán)重，隨著目前環(huán)境壓力的增加和資源原料價格的上升，傳統(tǒng)的蛋白水解提取法正逐漸被市場淘汰。微生物發(fā)酵法正以其綠色環(huán)保的工藝、原料和成本低廉的優(yōu)勢迅速發(fā)展起來。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)羥脯氨酸的研究還處于實驗室階段，尚未形成成熟的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，而先進(jìn)的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，尤其是菌種的固體培養(yǎng)配方及方法對于羥脯氨酸的發(fā)酵單位、成本和三廢排放有重要影響。福建師范大學(xué)黃建忠等人利用大腸桿菌HYP035(Escherichia#coli.HYP035)生產(chǎn)羥脯氨酸,其發(fā)酵液中羥脯氨酸產(chǎn)量為45g/L，脯氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85％,發(fā)酵周期為40h。江南大學(xué)張震宇等人利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸,通過利用脯氨酸-4-羥化酶基因和色氨酸啟動子序列,先優(yōu)化設(shè)計色氨酸串聯(lián)啟動子和脯氨酸-4-羥化酶結(jié)構(gòu)基因,然后全基因合成色氨酸串聯(lián)啟動子基因和脯氨酸-4-羥化酶結(jié)構(gòu)基因后,將啟動子和結(jié)構(gòu)基因連接到pAMP質(zhì)粒上,構(gòu)建了可過量表達(dá)脯氨酸-4-羥化酶的重組質(zhì)粒pAMP-P2trp-Hyp,將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建出重組大腸桿菌；搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,該重組大腸桿菌的羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到0.31g/L。

另外，現(xiàn)有技術(shù)中自發(fā)酵液中分離提取羥脯氨酸，通常采用離子交換方法，將除去菌體的發(fā)酵液在特定的pH條件下上柱，讓羥脯氨酸吸附在離子交換柱上，隨后用去離子水對離子交換柱充分洗滌，除去雜質(zhì)，然后用洗脫液將羥脯氨酸從離子交換柱上洗脫，得到羥脯氨酸溶液，再經(jīng)過結(jié)晶和干燥，得到羥脯氨酸產(chǎn)品。該方法存在以下缺陷：①羥脯氨酸易氧化，收率不穩(wěn)定；②粗羥脯氨酸雜質(zhì)多、色澤深，影響精制收率及產(chǎn)品質(zhì)量。③耗水量大，酸堿用量大，在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢渣和廢水對環(huán)境造成非常嚴(yán)重的污染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供采用大腸埃希氏菌JL-HYP發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸的方法，該工藝發(fā)酵周期短，菌體密度高，羥脯氨酸的產(chǎn)量和得率高。

采用大腸埃希氏菌JL-HYP發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸的方法，包括以下步驟：

步驟一、大腸埃希氏菌JL-HYP菌株經(jīng)斜面活化，生化培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20h，再經(jīng)梯度稀釋，涂布于LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，挑取單個菌落分別接種到LB斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱30-36℃培養(yǎng)12h；從LB斜面培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種到裝有種子培養(yǎng)基的種子瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度30-36℃、搖床轉(zhuǎn)速200rmp、培養(yǎng)時間6-8 h；當(dāng)OD值長到1.0-2.0時，得到種子液，備用；