[發(fā)明專利]一種體外篩選糖尿病腎病藥物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710684606.5
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107475346B
• 公開（公告）日: 2021-08-06
• 發(fā)明（設計）人: 林德良;蒿長英;鐘云;黃卉
• 申請（專利權）人: 北京漢典制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/26;C12Q1/28;C12Q1/54
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕

本發(fā)明提供了通過測定腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞和內皮細胞在給藥后單位細胞的培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度的變化和細胞增殖抑制率的變化，進行體外篩選糖尿病腎病藥物的方法。該方法不僅適用于小分子化合物的篩選，還特別適用于中藥組合物的組方配伍篩選和制備工藝篩選。應用該模型和方法篩選藥物，成本低、時間短、簡便易行、可靠性強，對于糖尿病腎病候選藥物的早期篩選具有重要意義。

技術領域

本發(fā)明涉及一種體外篩選藥物的方法，該方法主要用于篩選糖尿病腎病藥物。更具體地，本發(fā)明涉及一種采用高通量手段體外篩選糖尿病腎病藥物的方法。

背景技術

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是目前糖尿病最嚴重和最常見的并發(fā)癥之一，患者血管持續(xù)處于高糖狀態(tài)下而產生各種微血管病變致病。DN早期表現(xiàn)為腎臟細胞外基質增生、腎小球高濾過和腎小管高灌注。隨著病程的進展，引發(fā)腎小球和腎小管細胞進行性丟失，最終導致腎小球硬化和腎小管萎縮，腎間質纖維化。典型病理表現(xiàn)為：蛋白尿增多；腎小球濾過率(GFR)一過性增高，而后進行性下降；發(fā)生視網膜病變等微血管并發(fā)癥；腎小球基底膜增厚、系膜基質增生、結節(jié)性腎小球硬化、腎小管間質纖維化、動脈玻璃樣病變等。

目前在糖尿病腎病藥物篩選領域，最多采用的思路是使用動物模型進行篩選。通常使用的動物模型主要有如下五種：

(1)大劑量STZ注射誘導大鼠1型DN模型。一般注射后4-24周誘發(fā)DN。使用該模型存在的問題包括：1)動物死亡率高；2)腎臟病變比較緩和，不易形成腎小球硬化、小管間質纖維化等類似于人類DN中、晚期患者的腎臟病理改變；3)STZ具有腎毒性，會一定程度的干擾實驗結果；4)蛋白尿的嚴重程度與STZ劑量有關。

(2)小劑量STZ加高脂飼料誘導大鼠2型DN模型。該模型與人類2型DN較為接近，可出現(xiàn)幾乎全部人類DN的典型病變；尤其是腎小球硬化和腎小管-間質纖維化。目前，該模型在2型DN的發(fā)病機制與藥物篩選研究中的應用日益廣泛。但是，據(jù)文獻報道，小劑量STZ加高脂喂養(yǎng)5周后出現(xiàn)胰島素抵抗，再15周后出現(xiàn)輕度蛋白尿，因此造模時間較長。

(3)單側腎臟摘除加小劑量STZ誘導大鼠DN模型。腎臟摘除，不符合人類2型DN的發(fā)病過程；且據(jù)文獻報道，腎臟摘除加小劑量STZ誘導后20周才出現(xiàn)蛋白尿，且為重度，造模時間較長。

(4)自發(fā)性2型糖尿病大鼠OLETF。據(jù)文獻報道，36周時出現(xiàn)輕度蛋白尿，56周重度；因此造模時間長，且動物和飼料價格昂貴。

(5)自發(fā)性2型糖尿病小鼠KK-Ay。該模型在12周齡時出現(xiàn)早期DN病變，20周齡時出現(xiàn)近似于人類IV期DN的表現(xiàn)。但是，KK-Ay小鼠結節(jié)位于腎門附近，其不明顯，且范圍??；6-7個月出現(xiàn)腎盂積水，致使膀胱膨脹；7月齡時因腎衰竭的病死率很高；在研究DN終末期腎衰竭方面不具優(yōu)勢；不明原因梗阻性腎病。且KK-Ay小鼠8周齡時血糖升高糖尿病發(fā)病，20周齡左右血糖容易恢復而自愈或者出現(xiàn)高血糖致死。

綜上可知，DN動物模型普遍存在造模時間長、操作繁瑣、造價高、模型不穩(wěn)定等問題。這對于DN新藥研發(fā)時的藥物篩選和藥效評價來說，需要至少半年的時間，花費數(shù)十萬至百余萬元，且不可控因素較多。

因此，尋找一種簡便易行、可靠性強、操作簡單、檢測效率高的藥效篩選模型和方法，對于早期候選藥物在糖尿病腎病上的藥效考察具有重要意義和大量需求。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種體外篩選糖尿病腎病藥物的方法，方法中選定兩至三種腎臟細胞制作模型，可采用高通量手段篩選藥物。該模型和方法的優(yōu)點在于：成本低、時間短、簡便易行、可靠性強，對于糖尿病腎病候選藥物的早期篩選具有重要意義。