[發(fā)明專利]檢測霍亂弧菌的RPA-IAC引物及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710682435.2
• 申請日: 2017-08-10
• 公開（公告）號: CN107385057B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李志勇;周廣彪;凌莉;段建發(fā);易敏英;劉靜宇;陳碧玲;梁穎婕;魏霜
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州海關(guān)技術(shù)中心;汕頭海關(guān)技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12M1/34;C12R1/63
• 代理公司: 深圳國新南方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44374
• 代理人: 李明香

1.引物對和內(nèi)標(biāo)擴增序列，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述內(nèi)標(biāo)擴增序列為SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對和內(nèi)標(biāo)擴增序列在制備檢測或輔助檢測霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

3.一種試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物對和包含有權(quán)利要求1所述的內(nèi)標(biāo)擴增序列的質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括RPA恒溫擴增試劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述RPA恒溫擴增試劑為來自TwistDX公司的RPA擴增試劑盒TwistAmp Basic kits所包含的試劑。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括DNA提取試劑。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑還包括來自天根生化科技有限公司貨號為DP302的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒所包含的試劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照和陰性對照。

9.權(quán)利要求3-8中任一所述的試劑盒在非診斷目的檢測或輔助檢測霍亂弧菌，或制備檢測或輔助檢測霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

10.一種非診斷目的檢測或輔助檢測霍亂弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)RPA-IAC擴增：

以生物樣品或病原菌含有的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物對和包含有權(quán)利要求1所述的內(nèi)標(biāo)擴增序列的質(zhì)粒，或利用權(quán)利要求3-4中任一項所述試劑盒進行RPA-IAC擴增；

2)根據(jù)RPA-IAC擴增的結(jié)果判斷生物樣品是否感染霍亂弧菌，或病原菌是否為或候選為霍亂弧菌；

在步驟1)之前還包括在生物樣品或病原菌中提取DNA的步驟；

所述RPA-IAC擴增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：

若所述RPA-IAC擴增得到的擴增產(chǎn)物僅有大小為280bp的目標(biāo)基因片段，或同時擁有大小分別為337bp、280bp的內(nèi)標(biāo)擴增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為生物樣品感染霍亂弧菌，或病原菌為或候選為霍亂弧菌；若所述RPA-IAC擴增得到的擴增產(chǎn)物只有大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴增片段，未含有大小為280bp的目標(biāo)基因片段，則判定為生物樣品未感染霍亂弧菌，或病原菌不為或候選不為霍亂弧菌；若所述RPA-IAC擴增得到的擴增產(chǎn)物未含有大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴增片段且未含有大小為280bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)為假陰性，需要重新進行檢測；

所述RPA-IAC擴增的反應(yīng)體系如下：

含有凍干酶粉的0.2mL TwistAmp反應(yīng)管；再水化緩沖液：29.5μL；SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的引物各2μL，引物的終濃度均為0.4μmol/L；包含有SEQ ID NO：3所示的內(nèi)標(biāo)擴增序列的質(zhì)粒：1.81×10³copies；模板DNA：50ng；醋酸鎂溶液：2.5μL，濃度為280mmol/L；去離子水：補足至50μL；

所述RPA-IAC擴增的反應(yīng)條件如下：所述RPA-IAC擴增的溫度為37℃，時間為40min。