[發明專利]檢測霍亂弧菌的RPA-IAC引物及方法

有效

• 申請號: 201710682435.2
• 申請日: 2017-08-10
• 公開（公告）號: CN107385057B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 李志勇;周廣彪;凌莉;段建發;易敏英;劉靜宇;陳碧玲;梁穎婕;魏霜
• 申請（專利權）人: 廣州海關技術中心;汕頭海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12M1/34;C12R1/63
• 代理公司: 深圳國新南方知識產權代理有限公司 44374
• 代理人: 李明香

1.引物對和內標擴增序列，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述內標擴增序列為SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的引物對和內標擴增序列在制備檢測或輔助檢測霍亂弧菌的產品中的應用。

3.一種試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物對和包含有權利要求1所述的內標擴增序列的質粒。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括RPA恒溫擴增試劑。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述RPA恒溫擴增試劑為來自TwistDX公司的RPA擴增試劑盒TwistAmp Basic kits所包含的試劑。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括DNA提取試劑。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑還包括來自天根生化科技有限公司貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒所包含的試劑。

8.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照和陰性對照。

9.權利要求3-8中任一所述的試劑盒在非診斷目的檢測或輔助檢測霍亂弧菌，或制備檢測或輔助檢測霍亂弧菌的產品中的應用。

10.一種非診斷目的檢測或輔助檢測霍亂弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)RPA-IAC擴增：

以生物樣品或病原菌含有的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物對和包含有權利要求1所述的內標擴增序列的質粒，或利用權利要求3-4中任一項所述試劑盒進行RPA-IAC擴增；

2)根據RPA-IAC擴增的結果判斷生物樣品是否感染霍亂弧菌，或病原菌是否為或候選為霍亂弧菌；

在步驟1)之前還包括在生物樣品或病原菌中提取DNA的步驟；

所述RPA-IAC擴增的結果判斷的標準為：

若所述RPA-IAC擴增得到的擴增產物僅有大小為280bp的目標基因片段，或同時擁有大小分別為337bp、280bp的內標擴增片段和目標基因片段，則判定為生物樣品感染霍亂弧菌，或病原菌為或候選為霍亂弧菌；若所述RPA-IAC擴增得到的擴增產物只有大小為337bp的內標擴增片段，未含有大小為280bp的目標基因片段，則判定為生物樣品未感染霍亂弧菌，或病原菌不為或候選不為霍亂弧菌；若所述RPA-IAC擴增得到的擴增產物未含有大小為337bp的內標擴增片段且未含有大小為280bp的目標基因片段，判定為反應為假陰性，需要重新進行檢測；

所述RPA-IAC擴增的反應體系如下：

含有凍干酶粉的0.2mL TwistAmp反應管；再水化緩沖液：29.5μL；SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的引物各2μL，引物的終濃度均為0.4μmol/L；包含有SEQ ID NO：3所示的內標擴增序列的質粒：1.81×10³copies；模板DNA：50ng；醋酸鎂溶液：2.5μL，濃度為280mmol/L；去離子水：補足至50μL；

所述RPA-IAC擴增的反應條件如下：所述RPA-IAC擴增的溫度為37℃，時間為40min。