[發明專利]一種促血小板生成素的融合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710682261.X
• 申請日: 2017-08-10
• 公開（公告）號: CN109384849B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 李紅玉;張麗蕓;支德娟;王梅竹;李洋;趙晶;戴志娟;王亞亞
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81;C12N15/66;A61K38/19;A61P7/04
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1.一種促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模擬肽TMP二聯體，所述的人血清白蛋白HSA分子的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，編碼所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：3所示，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，其特征在于，所述的促血小板生成素模擬肽TMP二聯體是由酵母偏好密碼子編碼而成的，編碼所述促血小板生成素模擬肽TMP二聯體的氨基酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示，該融合蛋白還包括可形成二聚體化結構域的肽段，所述融合蛋白采用酵母細胞表達制備，所述的酵母為嗜甲醇畢赤酵母。

2.根據權利要求1所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚體化結構域的肽段中含有至少兩個半胱氨酸。

3.根據權利要求1所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚體化結構域的肽段中含有兩個半胱氨酸。

4.根據權利要求3所述的一種促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚體化結構域的肽段為H肽段，其氨基酸序列如Seq?ID?No:8所示。

5.根據權利要求4所述的促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述HSA連接于融合蛋白的N-末端，結構式表示為HSA-L2-H-L3-TMP-L1-TMP，L1、L3、L3表示肽接頭，L1的氨基酸序列為GGPSG，L2的氨基酸序列為GGGGSGL，L3的氨基酸序列為EFGGGGS，H表示可形成二聚體化結構域的H肽段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：6所示，編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：5所示。

6.權利要求5所述的一種促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚體化融合蛋白。

7.權利要求1至6任意一項所述的一種促血小板生成素的融合蛋白在制備治療原發性或繼發性血小板減少癥的藥物中的應用。

8.一種如權利要求1所述的促血小板生成素的融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟如下：

1)全基因合成酵母偏好密碼子編碼的促血小板生成素模擬肽TMP二聯體基因序列，所述促血小板生成素模擬肽TMP二聯體的基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；

2)通過PCR擴增獲取HSA分子基因序列，所述的HSA分子的基因序列如SEQ?ID?NO：3所示；

3)通過限制性內切酶酶切、連接并轉化大腸桿菌，獲得含編碼所述酵母偏好密碼子編碼的人血清白蛋白的融合蛋白與促血小板生成素模擬肽二聯體的DNA序列的重組表達載體；

4)提取步驟3)所述的重組表達載體并線性化，再轉化到宿主表達系統進行表達，純化表達上清，獲得所述融合蛋白。