[發(fā)明專利]一種基于生物膜滲透預(yù)測(cè)農(nóng)藥魚(yú)類LC50的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710678424.7
• 申請(qǐng)日: 2017-08-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107621506A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡喜運(yùn);黃雨薇;李越超;鄒德菲;陳景文;鄭永權(quán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 大連理工大學(xué)專利中心21200
• 代理人: 溫福雪,侯明遠(yuǎn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于污染物環(huán)境評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種基于生物膜滲透(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)預(yù)測(cè)農(nóng)藥魚(yú)類LC50的方法。

背景技術(shù)

我國(guó)是全世界農(nóng)藥施用量最大的國(guó)家之一。農(nóng)藥作為農(nóng)業(yè)集約化的產(chǎn)物，一方面，其在農(nóng)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著除草、殺蟲(chóng)、殺菌等至關(guān)重要的作用，保障了農(nóng)業(yè)的豐收及糧食的供應(yīng)；但另一方面，農(nóng)藥也是環(huán)境中最危險(xiǎn)的污染物之一，其本身具有毒性活性，在使用過(guò)程中殘留在環(huán)境中，再通過(guò)直接或間接的途徑進(jìn)入生物體對(duì)其產(chǎn)生危害。由于對(duì)環(huán)境以及人類健康有潛在的危害，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)、世界衛(wèi)生組織(WHO)、食品法典委員會(huì)等組織已經(jīng)將部分農(nóng)藥列入了優(yōu)先污染物名單中。

越來(lái)越多的農(nóng)藥通過(guò)各種途徑進(jìn)入水體且存在于環(huán)境中，被水生生物體吸收，產(chǎn)生毒害效應(yīng)，造成生態(tài)危害。虹鱒魚(yú)、大型蚤、發(fā)光菌等生物常用來(lái)評(píng)價(jià)污染物對(duì)生態(tài)的危害，然而逐一對(duì)農(nóng)藥的毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定需要消耗大量的人力、物力和財(cái)力，還有違背動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則(Reduction、Replacement、Refinement)等。

半數(shù)致死濃度(LC50)是評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)水生生物毒性的一個(gè)重要指標(biāo)，也是環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法需要考慮的一個(gè)重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，是通過(guò)監(jiān)測(cè)環(huán)境中農(nóng)藥的濃度來(lái)評(píng)價(jià)其風(fēng)險(xiǎn)，忽略了農(nóng)藥本身物理化學(xué)性質(zhì)的差異，沒(méi)有考慮到真正通過(guò)生物膜即被生物吸收的有機(jī)化合物的量。美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)(NRC)的年度報(bào)告中，Ehlers和Luthy首先提出了“生物有效性過(guò)程”這一個(gè)概念，其中生物有效性過(guò)程包括污染物在環(huán)境中的遷移；污染物通過(guò)生物膜被吸收；污染物與靶標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)合。其中污染物透過(guò)生物膜的過(guò)程非常重要，其是生物富集中重要的一步，亦是影響魚(yú)類LC50的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

現(xiàn)有關(guān)于污染物急性毒性的預(yù)測(cè)模型都是采用計(jì)算軟件對(duì)污染物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算從而建立QSAR模型，如專利CN201310705921.3公開(kāi)了一種通過(guò)量子化學(xué)方法構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系模型來(lái)預(yù)測(cè)有機(jī)化合物急性毒性的方法，該專利通過(guò)量子化學(xué)手段構(gòu)建了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)綠藻的急性毒性，驗(yàn)證集數(shù)據(jù)32種，R²＝0.805；專利CN201410053184.8公開(kāi)了一種通過(guò)定量構(gòu)效關(guān)系模型預(yù)測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)水生生物急性毒性的方法，具體方法是采用Gaussian程序進(jìn)行化合物的幾何優(yōu)化，然后進(jìn)行偏最小二乘逐步線性回歸，計(jì)算耗時(shí)長(zhǎng)，描述符多。由此可見(jiàn)，目前針對(duì)農(nóng)藥魚(yú)類LC50的預(yù)測(cè)模型很少，預(yù)測(cè)農(nóng)藥的種類單一、預(yù)測(cè)范圍小、預(yù)測(cè)效果不佳。目前農(nóng)藥對(duì)生物急性毒性作用的研究只考慮添加的農(nóng)藥濃度對(duì)生物體的影響，卻沒(méi)有考慮到真正的生物吸收，即農(nóng)藥的生物膜滲透。因此，有必要在考慮生物吸收的前提下，建立一種可以高通量快速預(yù)測(cè)農(nóng)藥魚(yú)類LC50的方法。

平行人工膜滲透模型(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)用于測(cè)定化合物的生物膜滲透率，是一種比傳統(tǒng)生物學(xué)方法更經(jīng)濟(jì)、高效、便捷的方法。其通過(guò)“三明治”結(jié)構(gòu)模擬不同的生物膜來(lái)測(cè)試不同生物組織的滲透率，從而評(píng)估農(nóng)藥魚(yú)類的LC50。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明對(duì)于現(xiàn)有預(yù)測(cè)農(nóng)藥魚(yú)類LC50技術(shù)的不足，建立一種基于生物膜滲透預(yù)測(cè)農(nóng)藥魚(yú)類LC50的方法，該方法通過(guò)測(cè)定生物膜的滲透率，建立農(nóng)藥LC50與滲透率等基本理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而評(píng)估農(nóng)藥魚(yú)類LC50。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種基于生物膜滲透預(yù)測(cè)農(nóng)藥魚(yú)類LC50的方法，步驟如下：

(1)數(shù)據(jù)匯總

通過(guò)查閱毒性數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)，獲得所要研究的農(nóng)藥的魚(yú)類LC50和理化性質(zhì)，理化性質(zhì)包括分子量、分子體積、熔點(diǎn)、分子極性、沸點(diǎn)、溶解度和辛醇-水分配系數(shù)；

(2)農(nóng)藥的滲透率測(cè)定

采用專利CN201610412443.0的方法，在供體池中加入0.05～1.0μg/mL農(nóng)藥溶液，在接收池中加入緩沖溶液，供體池中農(nóng)藥溶液和接收池中生物膜體液二者的體積相同；然后將供體池放入接收池中，確保人工膜和接收池中的緩沖溶液完全接觸；37℃孵育16h后，分別移取供體池和接收池中的溶液，然后通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜連用(LC-MS)進(jìn)行分析得到農(nóng)藥的峰面積，測(cè)定農(nóng)藥的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的濃度，并計(jì)算人工膜的表觀滲透率P_a和有效滲透率P_e；