[發明專利]閉管可視化鰻源嗜水氣單胞菌環介導等溫擴增檢測方法

有效

• 申請號: 201710676559.X
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107338314B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 熊靜;黃文樹;徐繼松;賴曉健;劉愛原
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

閉管可視化鰻源嗜水氣單胞菌環介導等溫擴增檢測方法，涉及水生動物病原微生物檢測。鰻鱺基因組提取；提取致病菌基因組；制備陽性對照；陰性對照制備；樣品檢測及結果判定。分別以嗜水氣單胞菌管家基因gyrB和致病因子hlyA保守序列，設計了LAMP引物，建立LAMP反應體系，并通過在LAMP反應中添加不同的pH指示劑，以達到閉管可視化判定靶基因是否被有效擴增的效果。采用閉管可視化快速檢測鰻源致病性嗜水氣單胞菌的方法，因為反應產物無須通過電泳和/或開管添加入熒光染料等鑒定，因此降低了LAMP產物的污染風險。

技術領域

本發明涉及水生動物病原微生物檢測，尤其是涉及一種基于環介導恒溫擴增技術的快速閉管可視化式、檢測鰻鱺致病性嗜水氣單胞菌氣單胞菌的方法。

背景技術

鰻鱺(Anguilla spp.)是世界名貴經濟魚類，鰻鱺養殖在我國已有近30年的歷史，養殖產量約占全球的70％，是我國出口創匯的重要產業之一。然而，在集約化高密度養殖過程中，鰻鱺細菌性疾病的爆發，嚴重制約了中國鰻鱺養殖業的健康可持續性發展(熊靜等.2017.7株鰻鱺致病性氣單胞菌毒力基因胞外產物及其活性比較,華中農業大學學報,2017,36(1):76-85)。嗜水氣單胞菌(Aermonas hydrophila)是一類條件致病菌，廣泛存在于水和土壤中，是我國養魚史上引發危害面積最大、損失最為嚴重的細菌性敗血癥的主要病原之一。該菌感染鰻鱺后導致魚體表出血、水腫、腹部膨脹及腎臟變黑等臨床癥狀，從而引發魚類敗血癥，造成大量死亡。國內外學者普遍認為，綜合預防是相對有效的方法，即盡早發現疾病并采取諸多措施阻止細菌傳播。因此，建立靈敏、準確、快捷、方便的嗜水氣單胞菌檢測方法是減少嗜水氣單胞菌的發生和危害的重要途徑。傳統嗜水氣單胞菌檢測主要是常規生化鑒定方法，由于氣單胞菌屬的種類繁多，而且它們的生化性狀極為相似，需要采取一系列生化鑒定反應才能夠鑒定到種，存在著操作繁瑣、檢測周期長、鑒定結果不準確等缺點，遠不能滿足日常快速檢測工作的需要。以酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assays，ELISA)為代表的免疫學技術雖比傳統鑒定方法簡單、快速，但前提是必需先制備相關抗體，同時由于該方法操作步驟繁瑣、影響因素較多，極易導致較高的假陽性率。以PCR技術為代表的分子生物學技術已成功應用于嗜水氣單胞菌的實驗室診斷，具有靈敏度高的優點，但需要依賴昂貴的熱循環系統，難以在基層中普及。由日本學者Notomi等提出的環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)在保留原有分子生物學技術特異性強、靈敏度高等優點的基礎上(Notomi et al.2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,28(12):E63)，實現了恒定溫度下對靶基因的高效擴增，脫離了對PCR儀等專業設備的依賴，更加適用于病原的臨床檢測。