[發(fā)明專利]犬白蛋白?干擾素α?白介素2融合蛋白、制備方法及其編碼基因、一種犬長效干擾素

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710676075.5
• 申請日: 2017-08-09
• 公開（公告）號: CN107286254A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙俊;李樹啟;高耀輝;戚仕梅;賴鵬飛;周煒;蔣敏之;劉家爐
• 申請（專利權(quán)）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61P31/12;A61P37/04;C12R1/19
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司34107
• 代理人: 任晨晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白、制備方法及其編碼基因、一種犬長效干擾素。將犬白蛋白、犬干擾素α和犬白介素2通過柔性柔性linker連接，得到犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白，設(shè)計(jì)優(yōu)化其編碼基因，最終制備得到重組犬長效干擾素。

背景技術(shù)

根據(jù)中國寵物行業(yè)現(xiàn)狀分析，截止到2014年末我國寵物行業(yè)的市場規(guī)模已經(jīng)達(dá)到1058億人民幣，而中國寵物醫(yī)療行業(yè)目前僅占約20％，相比較寵物行業(yè)相對成熟的美國市場，其寵物醫(yī)療的產(chǎn)值比達(dá)到50％，中國寵物醫(yī)療行業(yè)存在巨大的發(fā)展空間。

犬是人類忠誠的朋友，隨著國內(nèi)寵物犬等犬類飼養(yǎng)數(shù)量的大幅度增加，犬類疾病發(fā)病率、死亡率的不斷升高，給人類造成精神和經(jīng)濟(jì)上的雙重?fù)p失。犬與人類親密接觸導(dǎo)致人類被犬病毒感染的幾率極高，如狂犬病毒、犬細(xì)小病毒和犬瘟熱病毒等，都會給人類健康帶來極大的威脅。

據(jù)相關(guān)科學(xué)研究報(bào)道干擾素作為一類重要的細(xì)胞因子，在對犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、犬傳染性肝炎和犬冠狀病毒病等疾病的治療中均具有一定的療效。因此積極研究干擾素在犬病毒性疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

血清白蛋白是血漿的重要成分，正常情況下不易透過腎小球，體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是理想的藥物載體。

IFN是一類病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖以及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。現(xiàn)已知，α型IFN在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒等感染細(xì)胞，通過抑制受染細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用。但對正常宿主細(xì)胞無作用或作用微弱。IFN-α主要生物學(xué)活性為具有抑制病毒復(fù)制、抗寄生蟲、抑制多種細(xì)胞增殖、刺激免疫細(xì)胞的殺傷活性。

細(xì)胞因子IL-2即白細(xì)胞介素-2，又名T細(xì)胞生長因子。主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，既可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫功能，又能限制T細(xì)胞反應(yīng)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫耐受，故可用于治療腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在獸醫(yī)中，由于IL-2能提高疫苗的免疫應(yīng)答和減少疾病的發(fā)生，也出現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。IL-2因能增強(qiáng)機(jī)體的免疫水平，提高機(jī)體的抗病能力，因而用于細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲性疾病的免疫治療。此外，IL-2還可影響藥物的代謝，使藥物的代謝時(shí)間延長，作用時(shí)間增加，從而提高藥物療效。IL-2與其他細(xì)胞因子根據(jù)基因構(gòu)建，組成融合蛋白，以增強(qiáng)疫苗的抗體產(chǎn)生和提高細(xì)胞免疫水平。

天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個(gè)小時(shí)。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數(shù)的增加，相應(yīng)的時(shí)間成本及經(jīng)濟(jì)成本隨之增加，而機(jī)體的耐受極限也有可能被突破導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生。半衰期短的主要原因有兩個(gè)：干擾素的分子量過小在體內(nèi)代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統(tǒng)清除。

而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導(dǎo)致半衰期短的問題，同時(shí)聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于臨床上應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白及其制備方法，將犬白蛋白、犬干擾素α和犬白介素2通過柔性柔性linker連接，得到犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白。

本發(fā)明另一目的在于提供上述犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白的編碼基因。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種長效犬干擾素，利用上述犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白與凍干保護(hù)劑混合之后，經(jīng)冷凍干燥制備得到一種犬長效干擾素，所述犬長效干擾素可顯著提高犬干擾素的半衰期，較普通犬干擾素的半衰期提高18倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高犬自身的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本發(fā)明還提供的編碼犬白蛋白-干擾素α-白介素2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，記為基因組1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，記為基因組2。