[發(fā)明專利]血液病融合基因篩查方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710671180.X
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107245529A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹金良;夏成青;朱良俊
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州千麥醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州知通專利代理事務(wù)所(普通合伙)33221
• 代理人: 姚宇吉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種血液病融合基因篩查方法，屬于醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

白血病是一種造血干/祖細(xì)胞發(fā)生惡性變的異質(zhì)性造血系統(tǒng)腫瘤，以異常造血細(xì)胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血細(xì)胞減少為特征。在人群中發(fā)病率是3/10萬-4/10萬人口，且有逐年上升趨勢。白血病的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而多步驟的過程，其中基因組異常在白血病發(fā)病中起關(guān)鍵作用，這些異常包括染色體易位、基因突變等。在急性白血病中約50％以上的患者可發(fā)現(xiàn)特征性的非隨機(jī)染色體易位，大多數(shù)染色體易位累及在正常造血調(diào)控中起重要作用的基因如編碼轉(zhuǎn)錄因子或酪氨酸激酶的基因。染色體易位可形成具有腫瘤特性的融合基因，也可使一些在細(xì)胞生長/凋亡調(diào)控過程中起重要作用的基因表達(dá)失控，從而干擾細(xì)胞增殖、分化、成熟與凋亡的正常調(diào)節(jié)途徑。白血病分子生物學(xué)的研究，已成為當(dāng)代白血病研究的中心與主題。原有白血病的單純MIC(形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué))分型，已存在著嚴(yán)重不足，對臨床的化療和預(yù)后判斷具有一定的局限性，現(xiàn)已發(fā)展到在MIC分型的基礎(chǔ)上引進(jìn)了基因分型(M)，并隨著白血病基因分型的進(jìn)一步完善，對白血病診斷、制訂合理的治療方案及預(yù)后判斷有重要的指導(dǎo)意義。2002年世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)MICM(形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué))制定了新的分型標(biāo)準(zhǔn)，將白血病染色體結(jié)構(gòu)畸變以及融合基因作為基本診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。

目前融合基因的檢測技術(shù)多種多樣。在過去30年里，細(xì)胞遺傳學(xué)分析已成為遺傳學(xué)研究和惡性血液病臨床診斷的重要方法,染色體核型分析仍是檢測染色體畸變的常規(guī)方法。據(jù)報(bào)道已發(fā)現(xiàn)至少50多種與白血病相關(guān)類型特異的染色體易位。通過染色體核型分析很難識別如此眾多的染色體易位，而且，白血病往往不易獲得分散較好的容易分辨的核型，必須獲得足夠多的核型才能確切了解患者的染色體畸變情況。許多染色體易位和畸變即使有經(jīng)驗(yàn)的染色體核型檢測者，識別也十分困難，或根本不能用這種方法檢出。近年來新的分子生物學(xué)技術(shù)大大提高了細(xì)胞遺傳學(xué)分析的分辨率，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction PCR)是一種體外特定核苷酸序列擴(kuò)增技術(shù)，其特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR(nestedreverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR)技術(shù)，利用兩套PCR引物(巢式引物)對逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。可以將普通PCR的敏感性再提高100倍。因此，PCR擴(kuò)增染色體斷裂點(diǎn)易位形成的融合基因的方法得到了廣泛采用。由于使用上游、下游兩對引物，行兩次PCR反應(yīng)，因而一致認(rèn)為該種檢測方法較細(xì)胞遺傳學(xué)敏感，具有較高的靈敏度和特異性。目前靈敏度已達(dá)萬分之一到十萬分之一，是當(dāng)今檢測融合基因及MRD較靈敏手段。PCR方法雖然敏感和有效，但通常需要得知白血病是否有確切的染色體易位。在無法得知確切的染色體易位之前，只能對每個(gè)病例進(jìn)行多次獨(dú)立的PCR反應(yīng)，不僅浪費(fèi)大量時(shí)間和樣本，工作量也大，卻未必能獲得確切結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

(一)要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是提供一種血液病融合基因篩查方法，解決了現(xiàn)有的融合基因檢測，在無法得知確切的染色體易位之前，只能對每個(gè)病例進(jìn)行多次獨(dú)立的PCR反應(yīng)，不僅浪費(fèi)大量時(shí)間和樣本，工作量也大，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的缺陷。

(二)技術(shù)方案

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種血液病融合基因篩查方法，包括以下步驟：

提取人體血液RNA樣本，得到RNA模板；

使用包括多種的血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液分組對RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

將cDNA分組進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增；

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到陽性分組；

將陽性組的單管進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增；

將陽性組的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定融合基因類型。

可選的，所述血液病融合基因?yàn)椋?/p>

可選的，所述血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物為：

可選的，所述巢式PCR擴(kuò)增包括兩輪擴(kuò)增程序，分別為第一輪擴(kuò)增程序和第二輪擴(kuò)增程序，每輪分為12個(gè)組別，每條特異性反轉(zhuǎn)錄引物的濃度為2pmol/μl；其中第一輪特異性反轉(zhuǎn)錄引物及分組為：