[發(fā)明專利]一株利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710669661.7
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107881123B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜岷;戴仲雪;信豐學(xué);張尚杰;章文明;顧紅煉;馬江鋒;董維亮
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/40;C12R1/865
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一株利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，它是在宿主菌中導(dǎo)入甲醇氧化酶基因aox1、二羥基丙酮合酶基因das、過氧化氫酶基因cta、二羥基丙酮激酶基因dak；

所述甲醇氧化酶基因aox1、二羥基丙酮合酶基因das、過氧化氫酶基因cta、二羥基丙酮激酶基因dak的GenBank登記號分別為XM_002494226.1、FJ752551.1、AB472085.1、XM_002493026.1；

其中，所述宿主菌為釀酒酵母。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，所述甲醇氧化酶基因aox1、二羥基丙酮合酶基因das、過氧化氫酶基因cta、二羥基丙酮激酶基因dak的啟動子序列分別選自PGK1p、TDH3p、PDC1p、FBA1p中的一種；

甲醇氧化酶基因aox1、二羥基丙酮合酶基因das、過氧化氫酶基因cta、二羥基丙酮激酶基因dak的終止子序列分別選自CYC1t、PGK1t、TDH2t、ENO2t中的一種。

3.權(quán)利要求1~2任一所述的利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1) 構(gòu)建如下四種表達(dá)框：PGK1p- aox1-CYC1t、TDH3p-das- PGK1t、PDC1p-cta-TDH2t、FBA1p-dak-ENO2t，再 使用重疊PCR將上述四種表達(dá)框、上游同源臂δ1、下游同源臂δ2、篩選標(biāo)記基因組合成重組基因片段；

(2) 將步驟（1）得到的重組基因片段轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，篩選重組菌，得到利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌。

4.權(quán)利要求1~2任一所述利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌在發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1a) 試管種子培養(yǎng)：將利用甲醇生產(chǎn)丙酮酸的基因工程菌接種到試管的種子培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18~22 h；

(2a) 搖瓶種子培養(yǎng)：將試管種子培養(yǎng)基接種到搖瓶的種子培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)22~26h；

(3a) 發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸：將搖瓶種子培養(yǎng)液進(jìn)行離心，去除上清種子培養(yǎng)基，并用滅菌水清洗菌體2次，并離心獲得菌泥，將菌泥重懸于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72~74h。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，其配方如下：20 g/L葡萄糖,10 g/L酵母粉 20 g/L蛋白胨，溶劑為水。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下：5 g/L硫酸銨，3 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L七水硫酸鎂，15 mg/L乙二胺四乙酸，4.5 mg/L七水硫酸鋅，0.3 mg/L六水氯化鈷，1 mg/L四水氯化錳，0.3 mg/L五水硫酸銅，4.5 mg/L二水氯化鈣，3mg/L七水硫酸亞鐵，0.4 mg/L二水鉬酸鈉，1 mg/L硼酸，0.1 mg/L碘化鉀，0.15 g/L尿嘧啶，10 g/L甲醇，溶劑為水。