[發明專利]基于F2蛋白的檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 201710669646.2
• 申請日: 2017-08-08
• 公開（公告）號: CN107607717A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 葉建強;王偉康;邵紅霞;秦愛建;田曉彥;梁廣成;萬志敏
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535;C07K14/075;C12N15/70
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司32252
• 代理人: 戴朝榮,鄭慧娟

1.一種基于F2蛋白的檢測血清4型禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，包括包被有纖突蛋白基因F2表達產物的ELISA酶標板，陽性陰性對照，HRP標記的兔抗雞二抗，樣品稀釋液、顯色液以及洗滌液。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為抗血清4型禽腺病毒的雞血清，陰性對照為SPF雞血清。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述包被有纖突蛋白基因F2表達產物的ELISA酶標板，是通過將純化的F2基因片段原核表達產物包被于96孔ELISA酶標板而制備。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述纖突蛋白基因F2的表達蛋白通過以下步驟得到：

(1)禽腺病毒分離:取疑似禽腺病毒感染的病死雞的肝臟，研碎后按1:5的比例加入PBS制成懸液；經微孔濾器過濾后，經尿囊腔接種8日齡SPF雞胚，接種后收取尿囊液；尿囊液經鑒定為血清4型禽腺病毒后，－20℃保存；

(2)禽腺病毒基因組的制備：首先將血清4型禽腺病毒分離毒株病毒經細胞裂解液裂解，隨后用酚、氯仿、異戊醇進行病毒基因組抽提，最后用無水乙醇沉淀，溶于30uL滅菌超純水，即得禽腺病毒基因組，置-20℃備用；

(3)PCR擴增pGEX-6p-1線性化載體以及FAdV-4病毒F2蛋白基因片段：設計出擴增血清4型禽腺病毒F2基因的引物以及pGEX-6p-1線性化載體的引物；以pGEX-6p-1原核表達載體以及禽腺病毒基因組為模板，利用相應引物分別PCR擴增出線性化的pGEX-6p-1載體以及禽腺病毒F2基因序列；

(4)p-FAdV-F2重組表達載體構建：利用重組酶ExnaseTM II將線性化的pGEX-6p-1載體以及禽腺病毒F2基因的PCR產物進行快速體外重組克隆，重組克隆經序列驗證后，命名為p-FAdV-F2，挑取細菌克隆進行質粒制備，并進行PCR鑒定，鑒定的陽性克隆轉化到BL21細胞中進行誘導表達；

(5)F2原核表達質粒的表達及其產物的免疫反應性鑒定：擴增陽性克隆的BL21細胞，并以1：100接種于加AMP的LB培養基中，250rpm搖3h以后加入IPTG進行誘導表達，5h后收集細菌，用PBS重懸后40Hz，間隔8s進行破碎，破碎完成后離心分上清和沉淀；

(6)制備檢測禽腺病毒抗體的抗原:將BL21表達的融合表達產物GST-F2上清經GST標簽親和層析柱純化后得到纖突蛋白基因F2的表達蛋白。

5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液是指含0.05%Tween-20的PBST。

6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述顯色液是指TMB顯色液。

7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液是指含0.05％Tween-20的PBST。

8.按照權利要求1～7任一所述的試劑盒在血清4型禽腺病毒檢測中的應用。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述試劑盒檢測血清4型禽腺病毒抗體的步驟及陽性判定標準如下：將陽性血清1：100稀釋后，加入A1、A2孔，將陰性血清1：100稀釋后加入A3、A4孔，剩下的孔用于檢測待檢樣品，1:400稀釋，37度反應1小時；PBST洗滌3遍后，加入工作濃度的HRP標記的兔抗雞抗體，37度反應1小時；PBST洗滌3遍后，進行顯色10分鐘，之后加入終止液終止顯色。讀取OD450吸光值,OD450大于0.2的孔判為陽性。