[發(fā)明專利]一種抑制基因表達(dá)的RNA干擾方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710666720.5
• 申請日: 2017-08-07
• 公開（公告）號: CN107746857B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國世;李廣棟;崔煒;田秀芝;姬鵬云;呂東穎;吳昊;柴孟龍;連正興;阿布力孜·吾斯曼
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/85;C12N15/113
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發(fā)明提供一種抑制基因表達(dá)的RNA干擾方法，將目的基因的siRNA和含shRNA的質(zhì)粒同時(shí)顯微注射入目的基因所在的宿主細(xì)胞中。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種改良的抑制綿羊早期孤雌胚胎NLRP7基因表達(dá)的RNA干擾方法，是將NLRP7基因siRNA干擾片段和shRNA干擾質(zhì)粒混合注射入成熟卵母細(xì)胞中，所述siRNA如SEQ ID NO.6?7、8?9和/或10?11所示，所述shRNA如SEQ ID NO.14、16和/或18所示；孤雌激活后發(fā)現(xiàn)NLRP7基因敲降后的胚胎出現(xiàn)了發(fā)育異常，說明NLRP7是綿羊早期孤雌胚胎正常發(fā)育所需的關(guān)鍵基因。本發(fā)明方法為研究基因的功能提供了新的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種抑制基因表達(dá)的RNA干擾方法，具體地涉及一種特異性抑制NLRP7基因表達(dá)的RNA干擾方法。

背景技術(shù)

NLRs(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing)即NOD樣受體家族，是生物體眾多復(fù)雜的免疫識別系統(tǒng)之一，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同又劃分為好多亞家族，其中，將含有pyrin結(jié)構(gòu)域的亞家族稱為NLRP亞家族。NLRP基因家族首先在人身上被發(fā)現(xiàn)，共有十四個(gè)成員，分別命名為NLRP1-NLRP14。在靈長類動物上也有十四個(gè)成員，跟人的命名一樣。相比與人的NLRP基因家族，小鼠的NLRP基因家族中沒有NLRP7、NLRP8、NLRP11和NLRP13，但是NLRP1、NLRP4和NLRP9在進(jìn)化的過程中發(fā)生了變化，又分別命名為NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c、NLRP4a、NLRP4b、 NLRP4c、NLRP4d、NLRP4e、NLRP4f、NLRP4g、NLRP9a、NLRP9b、NLRP9c，總共有二十個(gè)成員。在大鼠中也沒有7、8、11、13，但只有NLRP4和NLRP9發(fā)生了變化，和小鼠不同的是，大鼠沒有NLRP4g和NLRP9c。研究表明，NLRP基因在哺乳動物進(jìn)化之前存在并發(fā)生復(fù)制，有一部分基因比較保守，如NLRP3(人和小鼠的同源性為80％以上)，然而，還有許多基因進(jìn)化迅速導(dǎo)致動物譜系間序列的差異，如NLRP5(人和小鼠同源性為50％左右)和NLRP14(人和小鼠同源性為60％左右)。此外，除了部分成員發(fā)生復(fù)制外，還有許多成員消失了，例如，NLRP8和NLRP13似乎在小鼠的進(jìn)化過程中退化了。在大動物上，該基因家族的研究并不是很多，許多物種的基因序列在NCBI 上都是預(yù)測的，盡管并不是在所有的物種中都有NLRP家族成員，但NLRP的同源基因在生物的進(jìn)化中是高度保守的。近年來，好多研究表明NLRP家族成員不止在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，還在哺乳動物生殖系統(tǒng)中發(fā)揮作用。巧合的是，NLRP基因家族的進(jìn)化過程中，主要基因的復(fù)制和消失都與生殖相關(guān)，比如NLRP4(復(fù)制)、NLRP7(缺失)、 NLRP8(缺失)、NLRP9(復(fù)制)、NLRP11(缺失)、NLRP13(缺失)和NLRP14等，這說明與生殖相關(guān)的基因在不同物種的系統(tǒng)發(fā)生過程中發(fā)生了快速的趨異進(jìn)化。近年來的研究顯示，對于人類和猴子等靈長類動物來說，許多NLRP基因在其配子和早期胚胎中表達(dá)，這表明NLRP基因在胚胎附植前的發(fā)育過程中起著某種作用(McDanielP等， 2009)。繁殖相關(guān)的NLRP基因聚集在人19號染色體上，而對小鼠來說，則是聚集到7 號染色體上。

NLRP7(NACHT，Leucine-rich repeat and PYD containing 7)是NLRP蛋白家族中的一員。NLRP7擁有NLRP蛋白家族通常的結(jié)構(gòu)域，比如亮氨酸重復(fù)域、NACHT結(jié)構(gòu)域和Pyrin結(jié)構(gòu)域，其位于人類19號染色體q13.42位置，小鼠身上沒有該基因。對于 NLRP7的研究主要集中在人和獼猴等靈長類動物身上，大動物上很少有報(bào)道，因此，我們選擇綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對象來研究NLRP7的功能。