[發(fā)明專利]一種經過突變改造的耐高溫海藻糖合酶及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710661311.6
• 申請日: 2017-08-04
• 公開（公告）號: CN107384888B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設計）人: 蘇靜;任緒東;王瑞明;汪俊卿
• 申請（專利權）人: 齊魯工業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/18;C12P19/12
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發(fā)明涉及一種經過突變改造的耐高溫海藻糖合酶及其應用。一種經過片段突變改造的耐高溫海藻糖合酶，其在Thermobaculum terrenum海藻糖合酶的第145至156位氨基酸由KDSRIIFIDTER片段突變?yōu)锳DTRIIFTDTEV，或者將第145位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸。本發(fā)明首次對海藻糖合酶的底物進入通道關鍵氨基酸進行了突變設計，改造后海藻糖合酶催化效率比原始的海藻糖合酶在相同反應條件下有一定的提高，特別體現在對反應平衡時間的影響，由原來的10個多小時達到平衡提高到4個小時就能平衡，這為海藻糖的工業(yè)化生產奠定了基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及一種經過突變改造的耐高溫海藻糖合酶及其應用，特別涉及一種經過改造的嗜熱菌Thermobaculum terrenum海藻糖合酶(trehalose synthase，TtTS)晶體結構及其應用，涉及了一種經過定向改造后獲得的熱穩(wěn)定性好，且催化效率高的海藻糖合酶及其應用，屬于生物技術技術領域。

背景技術

海藻糖(Trehalose)是一種由兩個吡喃環(huán)葡萄糖分子經α-1,1-糖苷鍵連接構成的非還原性二糖，廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體體內。研究表明，其性質穩(wěn)定，對生物體具有非常重要的生物學意義。主要表現在它是生物體能源和碳源的儲備物，是蛋白質和生物膜分子在脫水、高溫、氧自由基、低溫等惡劣環(huán)境中的穩(wěn)定劑和保護劑，是信號傳感復合物和生長調控因子，而且還是某些細菌細胞壁的組分之一，因此在科學界海藻糖有“生命之糖”的美譽。海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優(yōu)良活性保護劑以外，還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料。因此海藻糖可廣泛的應用到醫(yī)藥、化妝品業(yè)以及食品行業(yè)，具有誘人的開發(fā)應用前景和巨大的經濟效益。

鑒于海藻糖廣泛而重要的應用價值，尋找海藻糖高效方便、低成本生產方法的研究被廣泛重視。目前海藻糖的生產方法主要有酵母提取法、發(fā)酵法、酶合成法。其中酶法生產海藻糖具有較高的特異性和快速溫和等特點，已經成為研發(fā)海藻糖工業(yè)化生產的熱點并作為短期可見效的可行性途徑之一。

海藻糖合酶(EC5.4.99.16,Trehalose synthase,TreS)是一種分子內葡糖苷轉移酶它只需要一步反應就可以將麥芽糖的α-1,4糖苷鍵轉化為α-1,1糖苷鍵生成海藻糖。該酶反應流程短，易調控，不需要消耗高能物質，不需要磷酸鹽共存，只需要一種酶一步反應就能獲得海藻糖，因此海藻糖合酶轉化法是適宜工業(yè)化生產海藻糖的方法，有著良好的應用前景，受到廣泛的關注。到目前為止，國內外有報道的能夠產海藻糖合酶的微生物已經超過15種。不同微生物來源的海藻糖合酶的催化效率、酶學性質各有不同，但具有基本共同點：一是底物轉化率較低，最高只有80％左右，一般為60％-70％；二是酶的熱穩(wěn)定性較差，最適反應溫度為25℃左右；三是反應時間太長，一般為48小時，有的長達72h。

中國專利文獻CN104946610A(申請?zhí)?01510363951.X)公開了一種耐高溫海藻糖合酶及其表達基因與應用。改造后的耐高溫海藻糖合酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；改造后的耐高溫海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明首次根據惡臭假單胞菌海藻糖合酶(Pseudomonas putida KT2440)三維結構為基礎，截掉了結構中的柔性區(qū)，保留其活性中心的穩(wěn)定結構域，獲得了更加穩(wěn)定的海藻糖合酶。

發(fā)明內容

本發(fā)明針對現有技術的不足，提供一種經過突變改造的耐高溫海藻糖合酶及其應用，本發(fā)明通過對Thermobaculum terrenum海藻糖合酶進行定向改造后獲得耐高溫海藻糖合酶。該突變后的海藻糖合酶是在原始酶的晶體結構及其三維結構上進行定點突變，提高了其催化效率。

本發(fā)明技術方案如下：