[發明專利]特異性識別甲基化修飾DNA堿基的TALE RVD及其應用

有效

• 申請號: 201710660240.8
• 申請日: 2017-08-04
• 公開（公告）號: CN109384833B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 魏文勝;伊成器;張媛;郭生杰;朱晨旭;劉璐璐
• 申請（專利權）人: 北京大學;博雅輯因（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/90;C12Q1/44
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

1.包含TALE重復結構域的蛋白在制備檢測目標基因靶序列中的甲基化堿基5hmC的試劑中的應用，所述TALE重復結構域的一個或更多個RVD是FS。

2.檢測細胞基因組中目標序列的特定位點上是否存在5hmC的方法，包括：

(1)將包含TALE的蛋白引入細胞，所述TALE靶向目標序列，所述TALE中識別所述特定位點的RVD是FS；

(2)然后將核酸酶引入細胞，所述核酸酶的靶向切割位點位于TALE靶序列中；

(3)檢測目標序列是否被切割，由此判斷目標序列的特定位點上是否存在5hmC；如果目標序列未被切割，則所述TALE結合所述目標序列，使得所述核酸酶無法結合該目標序列并切割，所述特定位點上存在5hmC；如果目標序列被切割，則所述TALE未結合所述目標序列，所述核酸酶結合該目標序列并切割，所述特定位點上不存在5hmC。

3.權利要求2的方法，其中所述核酸酶是核酸內切酶。

4.權利要求2的方法，其中所述核酸酶是Cas9核酸酶，且在步驟(1)中將所述Cas9核酸酶和sgRNA共同引入細胞。

5.包含TALE的分離的DNA結合多肽、包含功能結構域和TALE的融合蛋白、編碼所述DNA結合多肽或所述融合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、或包含所述多核苷酸或所述載體的宿主細胞在制備靶向結合細胞中目標基因的靶序列的試劑中的應用，所述TALE包含的一種或更多種RVD是FS，目標基因的靶序列中在所述RVD的識別位點上是5hmC。

6.權利要求5的應用，其中所述功能結構域是調節基因表達的功能結構域、表觀遺傳修飾功能結構域，基因編輯功能結構域，或者熒光蛋白。

7.權利要求6的應用，其中所述調節基因表達的功能結構域是轉錄激活因子、轉錄抑制因子或其功能性片段，所述表觀遺傳修飾功能結構域是甲基化轉移酶、去甲基化酶或其功能性片段，所述基因編輯功能結構域是核酸酶或其功能性片段。

8.權利要求7的應用，其中所述基因編輯功能結構域是核酸內切酶。

9.權利要求8的應用，其中所述核酸內切酶是FokI核酸內切酶或FokI核酸內切酶的DNA切割域。

10.包含功能結構域和TALE的融合蛋白或編碼該融合蛋白的多核苷酸在制備調節細胞中目標基因表達的試劑中的應用，其中所述融合蛋白中包含的功能結構域是調節基因表達的功能結構域；

其中所述TALE包含的一種或更多種RVD是FS，目標基因的靶序列中在所述RVD的識別位點上是5hmC。

11.權利要求10的應用，其中所述調節基因表達的功能結構域是轉錄激活因子或其功能性片段，或者轉錄抑制因子或其功能性片段。

12.包含功能結構域和TALE的融合蛋白或編碼該融合蛋白的多核苷酸在制備對細胞中目標基因進行基因編輯的試劑中的應用，其中所述融合蛋白中包含的功能結構域是基因編輯功能結構域；

其中所述TALE包含的一種或更多種RVD是FS，目標基因的靶序列中在所述RVD的識別位點上是5hmC。

13.權利要求12的應用，其中所述基因編輯是核酸切割，所述基因編輯功能結構域是核酸酶或其功能性片段。

14.權利要求13的應用，其中所述基因編輯功能結構域是核酸內切酶或其功能性片段。

15.權利要求13的應用，其中所述基因編輯功能結構域是FokI核酸內切酶或其DNA切割域。